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Publication
Gold nanorods functionalized with DNA oligonucleotide probes for biosensing and plasmon-enhanced fluorescence detection
| Name: | Description: | Size: | Format: | |
|---|---|---|---|---|
| 14.76 MB | Adobe PDF |
Advisor(s)
Abstract(s)
Gold nanorods display plasmon resonances that are very sensitive to the refraction index
close to the particle’s surface. The site-selective functionalization of Plasmon hot-spots with
bioreceptors is crucial to develop plasmonic sensors with improved response bycapturing the
target species at the most sensitive regions of the particle. Firstly, we used surface
immobilized biotin-functionalized gold nanorods for streptavidin sensing.The selective
functionalization of the nanorods’ tips was achieved with a CTAB bilayer and using a thiol
linker to attach the desired biotin functionality. The sensor performance was characterized by
measuring binding kinetic assays. In the recent years, Dengue virus DENV-2 has been
reported as the largest dengue epidemic type and early stage detection of this virus would
save the life of many patients. Thus, a plasmonic model biosensor was designed for the
detection of RNA sequences proposed as disease biomarkers for Dengue virus.For this
purpose, we have functionalized gold nanorods with thiolated DNA oligonucleotide probes
complementary to a RNA sequence of Dengue virus.As a signal amplification strategy, we
have used biotin-labeled oligonucleotide target sequences, in order to bind streptavidin or
anti-biotin antibody to increase the surface plasmon response.
Plasmon-enhanced fluorescence (PEF) microscopy provides fast, high-contrast, and lowbackground
detection of single molecules. The interaction between the localized surface
plasmon of gold nanorods and a fluorophore in their vicinity can induce the acceleration of
excitation and decay rates thus leading to substantial fluorescence enhancements. In the third
part of this Thesis, it was studied the interaction between gold nanorod antennas and a weakly
fluorescence dye, TMPyP porphyrin. This interaction was mediated by electrostatic attraction
between the tetracationic TMPyP and the DNA oligonucleotide coating on the nanorods’
surface.
Preliminary measurements of optical spectroscopy were carried out to characterize the
interaction in solution of TMPyP and single or double-stranded DNA oligonucleotides
complementary to a RNA sequence of Dengue virus.The apparent equilibrium constants for
the complex of TMPyP with single and double-stranded DNA were determined to be Ka=
3.9×107 M-1and 4.5×107 M-1respectively. The spectral changes show a strong specific
intercalation of TMPyP with ds-DNA and ss-DNA because of GC-rich sites in the selected
sequences. Next, the plasmon-enhanced fluorescence of TMPyP induced by gold nanorods
was investigated using confocal fluorescence lifetime microscopy to perform measurements
of nanoparticle emission intensity and spectrum, fluorescence correlation spectroscopy,
emission intensity time trace and fluorescence decay. The gold nanorods were immobilized
on glass and functionalized with a thiolated oligonucleotide coating, while TMPyP molecules
are diffusing in solution and stochastically interact with the rod’s surface. The emission
intensity traces measured on single particles show strong fluorescence bursts when TMPyP
molecules come into close proximity of the nanorod. We have calculated the emission
enhancement factors from a comparison with the non-enhanced emission of TMPyP in the
same experimental conditions and found surprisingly large enhancement factors of around
60000-fold for TMPyP’s emission.These values of enhancement are two orders of magnitude
larger than our calculated highest enhanced fluorescence expected for TMPyP molecule.
Os nano-bastonetes de ouro são caracterizados por plasmões de superfície com frequências de ressonância bastante sensíveis ao índice de refração na proximidade da sua superfície. A funcionalização seletiva da superfície destas nanopartículas com bio-receptores é crucial para o desenvolvimento de sensores plasmónicos com resposta melhorada, pois permite a captura de analitos nas regiões mais sensíveis da nanopartícula. Em primeiro lugar foram preparadas superfícies com nano-bastonetes de ouro que depois foram funcionalizados com recetores biotina para ensaios modelo de deteção de estreptavidina. A funcionalização seletiva das extremidades dos nano-bastonetes foi conseguida através da proteção das suas paredes laterais com uma bicamada de tensioativo CTAB e usando uma biotina derivatizada com uma função tiól. O desempenho do sensor foi caracterizado por medidas da cinética de associação biotina-estreptavidina monitorizada por espectroscopia ótica de absorção. Em anos recentes, a infeção pelo vírus do Dengue DENV-2 tem sido relatada como a maior epidemia por este tipo de vírus, e a deteção precoce desta infeção poderia salvar a vida de muitos pacientes. Deste modo, foi desenhado um sensor plasmónico modelo para a deteção de sequências de ARN propostas como bio-marcadores para a infeção pelo vírus do Dengue. Para o efeito, foram funcionalizados nano-bastonetes de ouro com cadeias de oligonucleotídos de ADN complementares a uma sequência do ARN do vírus do Dengue. Como estratégia de amplificação de sinal foram usadas cadeias de oligonucleotídos alvo marcadas com biotina, de modo a ser possível num segundo passo ligar estreptavidina ou anticorpo anti-biotina com o objetivo de aumentar a resposta do plasmão de superfície dos nano-bastonetes de ouro. A fluorescência intensificada por efeito plasmónico permite a deteção rápida e com elevado contraste de molécula única em microscopia de fluorescência. A interação entre os modos localizados de plasmão de superfície de nano-bastonetes de ouro e moléculas fluorescentes na sua proximidade pode induzir a aceleração das taxas de excitação, decaimento radiativo e não-radiativo, e conduzir a uma intensificação de fluorescência.Na terceira parte desta Dissertação, foram investigadas as interações entre nano-antenas de ouro e um cromóforo pouco fluorescente, a porfirina TMPyP. Esta interação foi mediada pela atração eletrostática entre a porfirina tetra-catiónica e o revestimento de ADN na superfície dos nano-bastonetes de ouro. Ensaios preliminares de espectroscopia ótica foram realizados para caracterizar a interação em solução da TMPyP com sequências de ADN de cadeia simples ou duplacomplementares a uma sequência do ARN do vírus do Dengue. A constante aparente de equilíbrio para o complexo da TMPyP com as sequências de ADN de cadeia simples e dupla foram determinadas como sendo Ka= 3.9×107 M-1and 4.5×107 M-1, respetivamente. As alterações dos espectros de absorção e emissão mostram uma forte interação, provavelmente intercalação, daTMPyPcom ods-DNA,etambém com o ss-DNA, devido ao elevado conteúdo em pares GC nas sequências escolhidas. Em seguida, a fluorescência intensificada por efeito plasmónico na TMPyP induzida por nano-bastonetes de ouro foi investigada por microscopia confocal de tempos-de-vida, tendo sido realizadas medidas de intensidade e espectro de emissão de nanopartículas, espectroscopia de correlação de fluorescência, traços temporais de intensidade de emissão e de decaimento de fluorescência.Os nano-bastonetes de ouro foram imobilizados em vidro e funcionalizados com um revestimento de oligonucleotídostiolados, enquanto que as moléculas de TMPyP difundem-se em solução e podem interatuar estocasticamente com a superfície da nanopartícula. Os traços de intensidade de emissão medidos em nanopartículas individuais mostram picos de fluorescência intensos quando as moléculas de TMPyP se aproximam do nano-bastonete de ouro em resultado do efeito de nano-antena.Foram calculados os fatores de emissão intensificada por comparação com a emissão não-intensificada da TMPyP nas mesmas condições experimentais e obtiveram-se valores surpreendentemente elevados de cerca de 60000 vezes para a emissão intensificada da TMPyP. Estes fatores de intensificação são duas ordens de grandeza mais elevados do que as estimativas teóricas calculadas para a intensificação da emissão da TMPyP pelos nanobastonetes de ouro.
Os nano-bastonetes de ouro são caracterizados por plasmões de superfície com frequências de ressonância bastante sensíveis ao índice de refração na proximidade da sua superfície. A funcionalização seletiva da superfície destas nanopartículas com bio-receptores é crucial para o desenvolvimento de sensores plasmónicos com resposta melhorada, pois permite a captura de analitos nas regiões mais sensíveis da nanopartícula. Em primeiro lugar foram preparadas superfícies com nano-bastonetes de ouro que depois foram funcionalizados com recetores biotina para ensaios modelo de deteção de estreptavidina. A funcionalização seletiva das extremidades dos nano-bastonetes foi conseguida através da proteção das suas paredes laterais com uma bicamada de tensioativo CTAB e usando uma biotina derivatizada com uma função tiól. O desempenho do sensor foi caracterizado por medidas da cinética de associação biotina-estreptavidina monitorizada por espectroscopia ótica de absorção. Em anos recentes, a infeção pelo vírus do Dengue DENV-2 tem sido relatada como a maior epidemia por este tipo de vírus, e a deteção precoce desta infeção poderia salvar a vida de muitos pacientes. Deste modo, foi desenhado um sensor plasmónico modelo para a deteção de sequências de ARN propostas como bio-marcadores para a infeção pelo vírus do Dengue. Para o efeito, foram funcionalizados nano-bastonetes de ouro com cadeias de oligonucleotídos de ADN complementares a uma sequência do ARN do vírus do Dengue. Como estratégia de amplificação de sinal foram usadas cadeias de oligonucleotídos alvo marcadas com biotina, de modo a ser possível num segundo passo ligar estreptavidina ou anticorpo anti-biotina com o objetivo de aumentar a resposta do plasmão de superfície dos nano-bastonetes de ouro. A fluorescência intensificada por efeito plasmónico permite a deteção rápida e com elevado contraste de molécula única em microscopia de fluorescência. A interação entre os modos localizados de plasmão de superfície de nano-bastonetes de ouro e moléculas fluorescentes na sua proximidade pode induzir a aceleração das taxas de excitação, decaimento radiativo e não-radiativo, e conduzir a uma intensificação de fluorescência.Na terceira parte desta Dissertação, foram investigadas as interações entre nano-antenas de ouro e um cromóforo pouco fluorescente, a porfirina TMPyP. Esta interação foi mediada pela atração eletrostática entre a porfirina tetra-catiónica e o revestimento de ADN na superfície dos nano-bastonetes de ouro. Ensaios preliminares de espectroscopia ótica foram realizados para caracterizar a interação em solução da TMPyP com sequências de ADN de cadeia simples ou duplacomplementares a uma sequência do ARN do vírus do Dengue. A constante aparente de equilíbrio para o complexo da TMPyP com as sequências de ADN de cadeia simples e dupla foram determinadas como sendo Ka= 3.9×107 M-1and 4.5×107 M-1, respetivamente. As alterações dos espectros de absorção e emissão mostram uma forte interação, provavelmente intercalação, daTMPyPcom ods-DNA,etambém com o ss-DNA, devido ao elevado conteúdo em pares GC nas sequências escolhidas. Em seguida, a fluorescência intensificada por efeito plasmónico na TMPyP induzida por nano-bastonetes de ouro foi investigada por microscopia confocal de tempos-de-vida, tendo sido realizadas medidas de intensidade e espectro de emissão de nanopartículas, espectroscopia de correlação de fluorescência, traços temporais de intensidade de emissão e de decaimento de fluorescência.Os nano-bastonetes de ouro foram imobilizados em vidro e funcionalizados com um revestimento de oligonucleotídostiolados, enquanto que as moléculas de TMPyP difundem-se em solução e podem interatuar estocasticamente com a superfície da nanopartícula. Os traços de intensidade de emissão medidos em nanopartículas individuais mostram picos de fluorescência intensos quando as moléculas de TMPyP se aproximam do nano-bastonete de ouro em resultado do efeito de nano-antena.Foram calculados os fatores de emissão intensificada por comparação com a emissão não-intensificada da TMPyP nas mesmas condições experimentais e obtiveram-se valores surpreendentemente elevados de cerca de 60000 vezes para a emissão intensificada da TMPyP. Estes fatores de intensificação são duas ordens de grandeza mais elevados do que as estimativas teóricas calculadas para a intensificação da emissão da TMPyP pelos nanobastonetes de ouro.
Description
Keywords
Nanopartículas de ouro Biosensores plasmónicos Deteção de ácidos nucleicos Fluorescência intensificada por efeito plasmónico Fluorescência de molécula única Porfirinas