Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10400.1/2745
Título: Synthesis of polymer nanoparticles sensitive to pH for DNA delivery in intracellular environment
Autor: Lopes, Eduardo
Orientador: Costa, Ana
Silva, Gabriela
Palavras-chave: Terapia génica
Vectores de entrega
RAFT
PDMAEMA
RPE
Data de Defesa: 2011
Resumo: Nos últimos anos, a terapia génica tem sido estudada como uma potencial abordagem para o tratamento de doenças de base genética. Este tipo de abordagem envolve o uso de plasmídeos, oligonucleótidos, ribozimas, entre outros, como um meio de modular a expressão genética e, consequentemente, gerar um efeito terapêutico. A célula apresenta várias barreiras à inserção de material genético no seu interior tais como a membrana celular, o sistema endossomal e a membrana nuclear. Posto isto, é crítico desenvolver métodos de entrega de DNA eficientes para que a terapia génica possa atingir todo o seu potencial. Em terapia génica, inicialmente foram utilizados métodos mecânicos e eléctricos para inserção do DNA no interior das células, recorrendo-se a estratégias como microinjecção, bombardeamento de partículas, pressão e eletroporação. Não obstante a enorme eficiência de transfeção destas técnicas, são contudo invasivas, laboriosas e difíceis de aplicar num cenário clínico. Face a estes constrangimentos, desenvolveram-se outras técnicas de entrega de material genético envolvendo o uso de vectores, dividindo-se estes em duas categorias: vectores de entrega virais e vectores de entrega não virais. Um vector de entrega deve possuir características tais como ser biodegradável, pouco tóxico e imunogénico, poder constituir uma formulação farmacêutica estável e ser altamente eficiente e específico no processo de transfecção. Milhões de anos de evolução tornaram os vírus em agentes infecciosos bastante eficientes, deste modo, vectores de entrega virais compreendem a aplicação de vírus tais como retrovírus, adenovírus, lentivírus, entre outros. A grande vantagem de recorrer a vírus como vectores de entrega de material genético é a elevada eficiência de transfecção resultante. No entanto, o uso de vectores virais pode desencadear resposta imunitária e/ou levar à potencial integração aleatória dos genes terapêuticos no genoma do hospedeiro, com consequências bastante negativas. Deste modo, o foco de atenção tem incidido na aplicação de vectores de entrega não virais numa óptica de contornar as desvantagens apresentadas. Por sua vez, os vectores de entrega não virais podem ser categorizados em sistemas de entrega lipossomais ou poliméricos. Os vectores de entrega lipossomais utilizados em terapia génica são numerosos, podendo ser catiónicos, aniónicos, sensíveis ao pH, camuflados ou imunolipossomas. No geral, a grande vantagem em se recorrer a este tipo de vectores é a baixa imunogenicidade dos lipossomas e a facilidade com que são manipuláveis a nível de formulação, sendo possível produzir lipossomas com características bastante definidas em termos de tamanho, carga de superfície, composição e morfologia. No entanto, apresentam desvantagens como citotoxicidade e pouca estabilidade. Os vectores de entrega poliméricos geralmente envolvem o uso de polímeros catiónicos uma vez que estes são capazes de complexar o DNA carregado negativamente por intermédio de interacções electrostáticas entre as cargas positivas presentes no polímero e os grupos fosfato na presentes na estrutura das moléculas de DNA, formando-se assim complexos denominados de poliplexos. Esta abordagem engloba o uso de polímeros como dendrímeros, PEI, PDMAEMA e quitosano. As vantagens mais importantes apresentadas por esta abordagem são a versatilidade de propriedades físico-químicas e facilidade de manipulação características dos polímeros. Dendrímeros tais como a PAMAM, apresentam vantagens a nível do controlo da sua síntese, sendo possível produzir polímeros bastante monodispersos, o que resulta numa elevada reprodutibilidade na entrega de material genético. Um dos polímeros mais estudados em terapia génica é o PEI. Trata-se de um polímero caracterizado pelo seu enorme potencial catiónico, traduzindo-se em elevadas eficiências de transfecção. A enorme desvantagem deste polímero é a sua elevada toxicidade, sendo que se desenvolveram estratégias de modo a amenizar esta característica. Uma alternativa bastante viável ao PEI é o PDMAEMA. Este polímero catiónico solúvel em água também é capaz de interagir eletrostaticamente com o DNA de modo a formar poliplexos. Vários estudos demonstraram que a eficiência de transfecção deste polímero é proporcional ao seu peso molecular. Este polímero apresentou uma elevada eficiência de transfecção in vitro (cerca de 10%) quando avaliado em células OVCAR-3. Para além dos polímeros sintéticos apresentados, os polímeros naturais como o quitosano são bastante apelativos para aplicações em terapia génica devido às suas baixas toxicidades e biodegradabilidade. Por outro lado, normalmente apresentam eficiências de transfecção mais baixas que os polímeros sintéticos. Tendo em conta o enorme potencial que reside na aplicação de polímeros para entrega de DNA no interior das células, a síntese de polímeros é por isso de uma fulcral importância. Um dos processos mais usados na síntese de polímeros é a polimerização radicalar, sendo que a polimerização via RAFT sobressai de entre as demais técnicas devido à sua versatilidade em termos de condições de reacção e controlo sobre os pesos moleculares dos polímeros sintetizados. Outra característica digna de relevo é a baixa polidispersidade de pesos moleculares de polímeros formados por intermédio de polimerização via RAFT. O objectivo deste trabalho foi avaliar se o PDMAEMA é um bom candidato para ser usado em terapia génica na retina. Para tal, PDMAEMA foi sintetizado por RAFT, com uma previsão inicial de peso molecular de 200 kDa. Posteriormente, o polímero resultante foi avaliado em termos de propriedades físico-químicas e biológicas. A estrutura do polímero foi confirmada por intermédio de espectroscopias de H1 NMR e FTIR, pelo que a síntese, a nível químico, foi um sucesso. De modo a se avaliar a massa molecular do polímero, procedeu-se a uma GPC. Por intermédio desta técnica, verificou-se que o polímero sintetizado apresentava uma massa molecular média de 354 kDa, valor este superior ao esperado. Subsequente caracterização do polímero envolveu a execução de uma titulação potenciométrica, sendo que se verificou que o PDMAEMA tem um pKa de cerca de 7, muito próximo do pH fisiológico. O valor obtido revela que este polímero é potencialmente capaz de manter material genético encapsulado a valores de pH inferiores a 7 (como por exemplo no interior de um endossoma cujo pH ronda os 5) e, por outro lado, libertar o mesmo a um pH igual ou superior ao fisiológico. O PDMAEMA foi avaliado em termos de toxicidade por intermédio de um ensaio de contacto directo entre células e polímero. A toxicidade do material foi então avaliada nas linhas celulares HEK293, ARPE-19 e D407, sendo que as duas últimas são derivadas de células RPE, constituindo um modelo in vitro de células da retina. As viabilidades celulares foram avaliadas por intermédio do ensaio de MTT. Os resultados deste ensaio revelaram que a toxicidade do polímero é não só proporcional à sua concentração mas também ao tempo de duração do ensaio de incubação. Verificou-se também que a toxicidade do PDMAEMA é substancialmente mais acentuada nas linhas celulares RPE relativamente à HEK293. Não obstante este resultado, a concentração do material a usar num ensaio in vivo torna estes valores negligenciáveis. Por intermédio de electroforese em gel de agarose, verificou-se que poliplexos de PDMAEMA/pDNA nas razões N/P de 5, 10 e 20 encapsularam e protegeram o DNA de degradação por parte de DNases. Um ensaio de libertação efectuado em poliplexos na razão N/P de 10 revelou que estes começam a libertar o material genético após 72 h, a pH fisiológico. Poliplexos de PDMAEMA/pDNA a várias razões N/P (5, 10, 20), foram caracterizados em termos de tamanho e magnitude de carga de superfície por intermédio de medições de DLS e potencial zeta, respectivamente. Estas medições revelaram poliplexos com tamanho médio de 213 nm e índices de polidispersidade aceitáveis. O tamanho das partículas verificou-se ser inversamente proporcional à razão N/P. No que respeita aos potenciais zeta, a magnitude de carga média na superfície dos poliplexos foi de 18 mV. Os potenciais zeta obtidos foram não só positivos em todos os casos mas também directamente proporcionais à razão N/P, o que nos indica que poliplexos de PDMAEMA/pDNA interagem electrostaticamente com as cargas negativas à superfície das membranas biológicas, potencialmente facilitando a sua internalização. A eficiência de transfecção de poliplexos nas razões N/P de 5, 10 e 20 foram avaliadas pela expressão do gene repórter GFP nas três linhas celulares previamente estudadas para avaliação de toxicidade. A avaliação do número de células GFP-positivas foi efectuada por intermédio de microscopia de fluorescência. Verificou-se que todas as linhas celulares foram eficientemente transfectadas pelos poliplexos, pese embora a eficiência de transfecção ter sido inferior nas linhas celulares RPE. Ensaios preliminares para a avaliação da eficiência de transfecção em células ARPE-19, por intermédio de citometria de fluxo, aparentemente não indicaram a real eficiência de transfecção deste polímero. Tomando em linha de conta os resultados como um todo, é seguro afirmar que o PDMAEMA é um candidato viável para terapia génica na retina.
Gene therapy is a potentially great therapeutic approach for a wide range of diseases. Consequently, it is critical to develop adequate delivery vectors. In this study, we evaluated if poly(2-(N,N’-dimethylamino)ethyl methacrilate) (PDMAEMA), which proved to be an efficient delivery vector for OVCAR-3 cells, is also suitable to transport nucleic acids to the retina. In this regard, reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization (RAFT) was used to synthesize PDMAEMA with a weight-average molecular weight (Mw) of 200 kDa. H1 NMR and Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy confirmed the chemical structure of the polymer and potentiometric titration showed that PDMAEMA has a pKa value around 7. However, gel permeation chromatography (GPC) analysis revealed that the polymer obtained had a Mw of 354 kDa. The cytotoxicity of PDMAEMA was evaluated in retinal pigment epithelium (RPE) cell lines ARPE-19 and D407, as well as in Human Embryonic Kidney 293 (HEK293) cells and was found to be proportional to polymer concentration. However, for the concentration to be used in vivo, the cytotoxicity was negligible. Polyplexes of polymer/DNA with nitrogen/phosphorus (N/P) ratios of 5 and 10 were able to encapsulate and protect DNA from DNase action. Dynamic light scattering (DLS) and zeta potential measurements revealed nanosized particles with sizes around 213 nm with acceptable polydispersity indexes (PDI) and positive surface charges with magnitudes around 18mV. Fluorescence microscopy showed all three cell lines were efficiently transfected with these polyplexes, although to a lesser extent in RPE cells. However, preliminary evaluation of transfection efficiency by flow citometry, did not seem to reflect the effectiveness of the polymer in terms of cell transfection Altogether these results suggest that PDMAEMA is a good candidate as a non-viral delivery vector for gene therapy of the retina.
Descrição: Dissertação de mest., Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Univ. do Algarve, 2011
Peer review: yes
URI: http://hdl.handle.net/10400.1/2745
Designação: Mestrado em Ciências Biomédicas
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