Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10400.1/5974
Título: Development of a Piggybac based direct reprogramming system for derivation of integration free induced pluripotent stem cells
Autor: Matias, Dino Emanuel Santos
Orientador: Tiscornia, Gustavo
Palavras-chave: Ciências biomédicas
Biologia celular
Desenvolvimento
Transposição
Clonagem
Data de Defesa: 2013
Resumo: Induced pluripotent stem cells (iPSc) have great potential for applications in regenerative medicine, disease modeling and basic research. Several methods have been developed for their derivation. The original method of Takahashi and Yamanaka involved the use of retroviral vectors which result in insertional mutagenesis, presence in the genome of potential oncogenes and effects of residual transgene expression on differentiation bias of each particular iPSc line. Other methods have been developed, using different viral vectors (adenovirus and Sendai virus), transient plasmid transfection, mRNA transduction, protein transduction and use of small molecules. However, these methods suffer from low efficiencies; can be extremely labor intensive, or both. An additional method makes use of the piggybac transposon, which has the advantage of inserting its payload into the host genome and being perfectly excised upon re-expression of the transposon transposase. Briefly, a policistronic cassette expressing Oct4, Sox2, Klf4 and C-Myc flanked by piggybac terminal repeats is delivered to the cells along with a plasmid transiently expressing piggybac transposase. Once reprogramming occurs, the cells are re-transfected with transposase and subclones free of tranposon integrations screened for. The procedure is therefore very labor intensive, requiring multiple manipulations and successive rounds of cloning and screening. The original method for reprogramming with the the PiggyBac transposon was created by Woltjen et al in 2009 (schematized here) and describes a process with which it is possible to obtain insert-free iPSc. Insert-free iPSc enables the establishment of better cellular models of iPS and adds a new level of security to the use of these cells in regenerative medicine. Due to the fact that it was based on several low efficiency steps, the overall efficiency of the method is very low (<1%). Moreover, the stochastic transfection, integration, excision and the inexistence of an active way of selection leaves this method in need of extensive characterization and screening of the final clones. In this work we aime to develop a non-integrative iPSc derivation system in which integration and excision of the transgenes can be controlled by simple media manipulations, avoiding labor intensive and potentially mutagenic procedures. To reach our goal we developed a two vector system which is simultaneously delivered to original population of fibroblasts. The first vector, Remo I, carries the reprogramming cassette and GFP under the regulation of a constitutive promoter (CAG). The second vector, Eneas, carries the piggybac transposase associated with an estrogen receptor fragment (ERT2), regulated in a TET-OFF fashion, and its equivalent reverse trans-activator associated with a positive-negative selection cassette under a constitutive promoter. We tested its functionality in HEK 293T cells. The protocol is divided in two the following steps: 1) Obtaining acceptable transfection efficiency into human fibroblasts. 2) Testing the functionality of the construct 3) Determining the ideal concentration of DOX for repressing mPB-ERT2 expression 4) Determining the ideal concentration of TM for transposition into the genome 5) Determining the ideal Windows of no DOX/TM pulse for transposition into the genome 6) 3, 4 and 5) for transposition out of the genome 7) Determination of the ideal concentration of GCV for negative selection We successfully demonstrated that ENEAS behaved as expected in terms of DOX regulation of the expression of mPB-ERT2. We also demonstrated that by delivering the plasmid into 293T HEK cells and manipulating the levels of DOX and TM in the medium, we could obtain puromycin resistant lines. The number of puromycin resistant colonies obtained was significantly higher when DOX as absent, suggesting that the colonies resulted from transposition events. Presence of TM added an extra layer of regulation, albeit weaker. Our PCR analysis, while not a clean as would be desired, suggested that transposition was indeed occurring, although a background level of random integration could not be ruled out. Finally, our attempt to determine whether we could use GVC to select clones that had successfully mobilized PB out of the genome was unsuccessful. Unexpectedly, 293T HEK cells that had been transfected with ENEAS and selected for puromycin resistance were insensitive to GCV.
Reprogramação celular é a tecnologia mais recente no campo da biologia celular e desenvolvimento. A possibilidade de reverter qualquer tipo celular a um estado de pluripotencia, a partir do qual possa ser diferenciado em qualquer outro do corpo humano, independentemente da célula de partida abriu toda uma panóplia de possibilidades e conceitos em Biomedicina. As propriedades intrínsecas das células iPS de divisão simétrica e pluripotencia, semelhantes às das células estaminais, tornam-se especialmente importantes para os ramos da medicina regenerativa e investigação biomédica, com realce para o desenvolvimento de modelos de doença in vitro, uma vez que contrariamente às células estaminais, só encontradas durante o desenvolvimento embrionário, as células iPS podem ser desenvolvidas a partir de um indivíduo adulto. Após obtenção de iPSs é possível obter virtualmente um número ilimitado de qualquer género celular do dador, inclusive células de difícil obtenção, por falta de casos, difícil isolamento, ou falta de casos clínicos. O método original foi desenvolvido por Takahashi e Yamanaka e baseia-se na administração e expressão forçada de factores de transcrição, nomeadamente Oct4, Sox2, Klf4 e C-Myc (OSKC). Estes factores foram referenciados ao longo dos anos por estudos de transcriptómica comparativa entre vários clones de células estaminais versus células conhecidas como percursoras, ou progenitoras, conhecidas por manterem ainda algum grau de pluripotencia, e células somáticas adultas. Em 1962, John Gurdon mudou todo o campo conhecido como biologia do desenvolvimento ao gerar clones de rã através de transferência nuclear somática (SCNT), provando que toda a informação genética necessária para formar o indivíduo adulto permanece no núcleo das células somáticas, despertando assim uma revolução na área e ao desenvolvimento do conceito de reprogramação celular. De referir também a contribuição marcante de Davis e colegas que em 1987, usando um elegante método de extracção de ADN complementar detectaram um conjunto de três genes que se encontravam predominantemente expressos em mioblastos. A transcrição forçada de apenas um desses genes, Myod1, revelou-se capaz de converter fibroblastos em mioblastos capazes de expressar miosina, relatando assim, pela primeira vez um processo actualmente denominado por reprogramação directa ou transdiferenciação. Em relação ao processo de reprogramação propriamente dito, ainda há muito para descobrir. No entanto alguns mecanismos já foram deslindados nestes sete anos. Apesar de já serem conhecidas novas combinações de factores que são capazes de reverter o estado de diferenciação celular estabelecido em diferentes tipos celulares, os quatro factores de Yamanaka, OSKM continuam a ser o padrão na área, principalmente pela sua robustez e capacidade de reprogramar a maioria dos tipos celulares. Os factores OSKM têm um efeito sinergético, funcionando em conjunto para ultrapassar os resilientes sistemas celulares intrínsecos de protecção de identidade. Assim, neste sistema, a expressão de Oct4 e Sox2 promove maioritariamente um efeito desestabilizador da ordem transcripcional estabelecida, recrutando NANOG, outro agente de pluripotencia e formando um núcleo autoregulatório de pluripotencia. Este núcleo, uma vez estabelecido activa vias de sinalização como a via da MAPK1 e WNT3, e sinalizando o grupo Polycomb. Por outro lado, os factores Klf4 e c-Myc, como reguladores da divisão celular, têm uma actividade mitogénica, obrigando a alterações constantes no estado epigenético da célula, aumentando fortemente a cinética e eficiência do processo. Ainda que, ao momento, desenvolvimento de iPSs utilizando vectores virais integrativos de função semelhante aos utlizados na publicação original não seja já considerado um desafio a nível laboratorial, a transposição desses produtos para a investigação e aplicações clínicas tem sido problemático. Em primeiro lugar, existem evidências que na sua maioria, os clones de iPS mantêm algum nível de marcação epigenética reminiscente do tipo celular a partir do qual foram desenvolvidas; em segundo lugar, os métodos de entrega dos factores de reprogramação não integrativos são muito ineficientes, ao passo que os métodos integrativos induzem mutações insercionais, não sendo assim nem seguros nem desejáveis para aplicações clínicas; em terceiro e último lugar, desenvolvimento, expansão e caracterização de clones de iPS é um processo largamente moroso, lento e caro. Assim, torna-se evidente a necessidade imperiosa de desenvolvimento de protocolos de entrega de factores e reprogramação que permitam uma transposição segura para a clinica e garantam a aquisição de células de melhor qualidade para a investigação, garantindo a qualidade e confiança nos resultados. Ao aliar a eficiência e reprodutibilidade dos métodos de reprogramação integrativos com a possibilidade de posterior excisão, os transposões, nomeadamente o PiggyBac, devido à sua ínfima taxa de mutação após excisão, surge como vector muito promissor para a administração de factores com vista à reprogramação celular. O presente trabalho surge neste contexto como uma contribuição para o desenvolvimento de um sistema de reprogramação baseado no transposão PiggyBac que seja simples e rápido, dispensando caracterização molecular após obtenção de iPSs. Por motivos de limitação de carga o sistema foi dividido em dois vectores a seres co-transfectados na população inicial de fibroblastos. O primeiro vector, Remo, é composto pela cassete de reprogramação contendo os factores OSKM e GFP sobre a expressão de um promotor constitutivo (CAG). O segundo vector, Eneas, é constituído pelo gene da transposase de codão optimizado para ratinho (mPB) associado a um receptor de estrogénio (ERT2) sobre a regulação de um sistema repressível por tetraciclina (TET-OFF). No extremo 3´ encontra-se ainda o transactivador reverso capaz de regular o promotor TET. Ambos os vectores contêm uma cassete de selecção positiva-negative e são flanqueados por sequências TR 5´ e 3´ específicas do transposão PiggyBac. O protocolo consiste de duas partes: numa primeira instância, através de um pulso de expressão de mPB ambos os plasmídeos são transpostos para o genoma, permitindo expressão da cassete de reprogramação OSKM; posteriormente, após obtenção de colónias de iPSs, um segundo pulso seria imposto, de modo a permitir remobilização e obtenção de colónias iPS sem integração. Integração e mobilização serão controladas pela cassete de selecção positiva-negativa. De modo a estabelecer o sistema os seguintes objectivos foram traçados: a) Clonar ENEAS; b) Escolha de um sistema de transfecção que permitisse altos níveis de transfecção em fibroblastos humanos. c) Testar a funcionalidade do sistema em termos de: a. Concentração de DOX necessária para reprimir a expressão de mPB; b. Concentração de TM ideal para transposição; c. Janela temporal de expressão de mPB; d. Definir a, b e c para o processo de remobilização; e. Concentração ideal de GCV para selecção negativa. A clonagem do vector ENEAS foi lograda e confirmada por digestão com quatro enzimas distintas e posterior sequenciação. A funcionalidade de ENEAS foi testada em células HEK 293T. Por RT-PCR provou-se a repressão da expressão de mPB à concentração de 2 μg/ml de DOX. A concentração de TM foi titulada e confirmada quer pela bibliografia quer pelos testes de transposição com diferentes janelas temporais. Três janelas temporais de expressão de mPB foram testadas: 24H, 48h e 72h, revelando-se a ultima a que melhores resultados gerava. Após obtenção de clones resistentes a puromicina, uma fracção dos mesmos foram expandidos sobre meio selectivo e quatro prosseguiram para caracterização por PCR genómico, de modo a averiguar se se tratavam de clones gerados por transposição catalisada por mPB. Apesar do surgimento de algumas dificuldades devido a amplificação de produtos de PCR na população controlo de 293T, as evidências apontam para que, ainda que nenhum dos quatro clones escolhidos tenha sido obtido apenas por transposição, diferentes intensidades de produtos de amplificação sugerem existência de transposição no sistema. Ainda que os resultados não tenham coincidido perfeitamente com o esperado, e uma nova bateria de testes tenha que ser desenhada de modo a aumentar o controlo sobre o sistema de transposição, provou-se a funcionalidade do sistema a nível molecular deixando esperança para que, em tempo, o conceito de concretize.
URI: http://hdl.handle.net/10400.1/5974
Designação: Mestrado em Ciências Biomédicas
Aparece nas colecções:UA01-Teses

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