Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10400.1/6054
Título: Synthesis and evaluation of polymer nanoparticles for delivery in RPE cells
Autor: Bitoque, Diogo B.
Orientador: Silva, Gabriela
Palavras-chave: Ciências biomédicas
Genoma humano
Olhos
Terapia génica
Polímeros
RPE
Data de Defesa: 2013
Resumo: Ocular pathologies are among the most debilitating medical conditions affecting all segments of the population. Traditional treatment options are often ineffective, and gene therapy has the potential to become an alternative approach for the treatment of several pathologies. Methacrylate polymers have been described as highly biocompatible and are successfully used in medical applications. Due to their cationic nature, these polymers can be used to form polyplexes with DNA for its delivery. This work aims to study the potential of PDMAEMA (poly(2-(N,N’-dimethylamino)ethyl methacrylate)) as a non viral gene delivery system to the retina. The first part of this work aimed to study the potential for gene delivery of a previously synthesized PDMAEMA polymer of high molecular weight (354kDa). In the second part, we synthesized by RAFT a PDMAEMA with a lower molecular weight (103.3kDa) and similarly, evaluated its ability to act as a gene delivery vehicle. PDMAEMA/DNA polyplexes were prepared at 5, 7.5, 10, 12.5 and 20 nitrogen/phosphorous (N/P) ratio for the 354kDa PDMAEMA and at 5 and 7.5 for the 103.3kDa PDMAEMA. Dynamic light scattering and zeta potential measurements confirmed the nanosize and positive charge of polyplexes for all ratios and for both polymers. Both high and low Mw PDMAEMA were able to efficiently complex and protect DNA from DNase I degradation. Their cytotoxicity was evaluated using a non-retinal cell line (HEK293) and a retinal pigment epithelium (RPE) cell line (D407). We have found that cytotoxicity of the free polymer is concentration and time dependent, as expected, and negligible for all the concentrations of the PDMAEMA-DNA polyplexes. Furthermore, for the concentrations to be used in vivo, the 354kDa PDMAEMA showed no signs of inflammation upon injection in the intravitreal space of C57BL/6 mice. The transfection efficiency, as evaluated by fluorescence microscopy and flow cytometry, showed that the D407 retinal cells were transfected by polyplexes of both high and low Mw PDMAEMA, but with varied efficiency, which was dependent on the N/P ratio. Althogether, these results suggest that PDMAEMA is a feasible candidate for non-viral gene delivery to the retina, and this work constitutes the basis of further studies to elucidate the bottleneck in transfection and further optimization of the material.
Desde o século passado que as doenças relacionadas com o genoma têm vindo a ganhar importância. O projecto de mapeamento do genoma humano permitiu descobrir a origem de muitas doenças. Várias abordagens terapêuticas têm sido objecto de estudo, sendo a terapia génica uma das mais promissoras. A terapia génica tem como objectivo usar material genético, em regra DNA, para manipular as células dos pacientes. Antes do aparecimento da terapia génica existia apenas tratamento dos sintomas ou terapia de substituição para várias patologias, e não uma verdadeira cura. Para as doenças oculares, que estão entre as doenças mais debilitantes que afectam todos os segmentos da população, esta realidade era sobretudo relevante. Em terapia génica existe a necessidade de desenvolver veículos para transporte de material genético, veículo este que tem que proteger o ácido nucleico de degradação, ter especificidade para células/órgão, permitir a expressão do gene de interesse ao longo do tempo e com níveis adequados, não desencadear resposta imunitária (excepto em caso de interesse como no cancro e vacinas) e que seja administrado por injecção sistémica. As duas principais estratégias para entrega de material genético usa vectores virais e não-virais. Os sistemas virais de entrega apresentam diversas vantagens, mas também várias limitações: imunogenicidade, baixa capacidade de empacotamento do material genético, potential inserção aleatória no genoma hospedeiro e toxicidade. Os vectores não virais, de entre os quais se destacam os polímeros, surgiram como uma alternativa para contornar esses problemas, pois estes apresentam maiores benefícios em termos de segurança, versatibilidade química e estrutural para a manipulação das propriedades fisico-químicas, maior capacidade de empacotamento de genes e estabilidade durante o armazenamento. Dentro da classe dos polímeros, os polímeros naturais como o quitosano e alginato têm ganho importância devido à sua biocompatibilidade, mas são os polímeros sintéticos, como a poli(etilenimina) (PEI), a poli(L-lisina) (PLL) e o poli(2-dimetilamino)etil metacrilato (PDMAEMA), que tem maior relevância devido ao controlo preciso da sua síntese e consequentemente das suas propriedades. A natureza catiónica de alguns polímeros, como os indicados acima, permite que estes sejam usados para formar poliplexos com material genético. O objectivo do nosso grupo de investigação é o desenvolvimento de novas estratégias baseadas em terapia génica para tratamento de patologias da retina. Dentro deste enquadramento, o presente trabalho tem como objectivo compreender o potencial do poli(2-dimetilamino)etil metacrilato (PDMAEMA) como sistema de entrega de material genético na retina. Na primeira parte deste trabalho um polímero PDMAEMA com 354kDa, que tinha sido previamente sintetizado, foi avaliado para o seu potencial como veículo para terapia génica. Na segunda parte, sintetizamos um PDMAEMA com um menor peso molecular (103.3kDa) via RAFT (Reversible addition-fragmentation chain-transfer) para efectuar uma comparação entre a eficiência de transfecção de PDMAEMAs com diferentes pesos moleculares. Poliplexos de PDMAEMA/DNA foram preparados nos rácios amina(N)/fosfato(P) de 5, 7.5, 10, 12.5 e 20 com o PDMAEMA 354kDa e nos rácios 5 e 7.5 com o PDMAEMA 103.3kDa. Medições de DLS (Dynamic light scattering) e potencial zeta confirmam que foram preparados poliplexos à escala nanométrica com carga positiva, em todos os rácios. Ambos os polímeros PDMAEMA são capazes de complexar eficientemente e proteger o DNA da degradação por parte da DNAse I. A citoxicidade de ambos os polímeros foi avaliada usando duas linhas celulares: a HEK293 (linha celular de rim embriónico humano) e a D407 (linha celular de epitélio pigmentar da retina). Os resultados revelam que a citoxicidade do polimero livre (não-complexado) é dependente da concentração e do tempo de exposição, como esperado, e os poliplexos PDMAEMA/DNA não apresentam citoxicidade. Foi também observado que nas concentrações usadas in vivo a citoxicidade do PDMAEMA 354kDa é negligível, como demonstrado pela ausência de inflamação após a injecção no espaço intravítreo de ratinhos C57BL6. A eficiência de transfecção foi avaliada qualitativamente por microscopia de fluorescência e quantitativamente por citometria de fluxo e mostrou que os poliplexos PDMAEMA/DNA são capazes de transfectar, e que a eficiência varia de acordo com o rácio N/P utilizado, para os polimeros de alto e baixo peso molecular. Em suma, estes resultados sugerem que o PDMAEMA é um candidato viável para a entrega de genes na retina, e este trabalho constitui a base de estudos futuros que visam elucidar o passo limitante na transfecção e desse modo permitir a optimização deste vector não-viral.
URI: http://hdl.handle.net/10400.1/6054
Designação: Mestrado em Ciências Biomédicas
Aparece nas colecções:UA01-Teses

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