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The role of aromatic plant compounds in the prevention and treatment of neurological disorders
| Name: | Description: | Size: | Format: | |
|---|---|---|---|---|
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Authors
Advisor(s)
Abstract(s)
This thesis aims the discovery of valuable plant compounds and to provide a deep and
detailed scientific perspective of the following Portuguese aromatic plants: Lavandula viridis
L’Hér, Lavandula pedunculata subsp. lusitanica (Chaytor) Franco and Thymus lotocephalus
G. López & R. Morales. Volatile and phenolic compounds were recovered by different
techniques and extraction solvents and their antioxidant and anti-cholinesterase activities were
investigated (Chapters 2 and 3). In vitro cultures were used as alternative sources of
phytochemicals, and the results were compared with wild plants. Furthermore, the effect of
cyclodextrins on the antioxidant activity and storage stability of the essential oils was
evaluated (Chapter 4). Finally, the neuroprotective potential (Chapters 5) and the influence of
in vitro digestion on the biological activity of L. viridis extracts and rosmarinic acid
(Chapter 6) were investigated.
The supercritical fluid extraction technique generated the highest extraction yields in
comparison with hydrodistillation, but a larger number of components were identified by
hydrodistillation. The chemical analysis highlighted the abundance of oxygen-containing
monoterpenes in all the essential oils and in almost all supercritical fluid extracts, and allowed
the identification of phenolic acids and flavonoids in the polar extracts. The water:ethanol
mixture was the most efficient solvent for the extraction of phenolic compounds followed by
infusion. The in vitro cultures accumulated much higher contents of rosmarinic acid than wild
plants. The polar extracts were the most efficient free radical scavengers, Fe2+ chelators and
inhibitors of lipid peroxidation, while the essential oils were the most active against
cholinesterases. Cyclodextrins produced a remarkable enhancement on the antioxidant
activity and storage stability of the essential oils. L. viridis extracts attenuated the
neurotoxicity induced by H2O2 and their biological activity was assured after in vitro
digestion. This study provides relevant knowledge about the chemical composition and
biological activity of three Portuguese species.
A doença de Alzheimer é uma doença neurodegenerativa caracterizada pela deterioração progressiva e irreversível de diversas faculdades cognitivas e que afeta cerca de 35,6 milhões de pessoas em todo o mundo. Até ao momento, a doença permanece sem cura. A terapia disponível concentra-se apenas na atenuação dos sintomas característicos e a complexidade da patogénese constitui um obstáculo para o desenvolvimento de novos fármacos. Para além do défice progressivo e irreversível do sistema colinérgico, são claras as evidências do envolvimento do stresse oxidativo na doença. As plantas produzem compostos com interesse medicinal, e são uma fonte infindável de compostos biologicamente ativos. A Flora Portuguesa é, neste sentido, particularmente interessante pela sua riqueza em espécies aromáticas e medicinais. Esta tese pretende contribuir para a pesquisa de compostos biologicamente ativos a partir das seguintes espécies aromáticas de Portugal: Lavandula viridis L’Hér, Lavandula pedunculata subsp. lusitanica (Chaytor) Franco e Thymus lotocephalus G. López & R. Morales. Estas espécies são usadas como condimentos ou para fins terapêuticos na medicina tradicional, no entanto, o seu potencial biológico ainda não foi totalmente explorado. A primeira fase deste trabalho, descrita nos Capítulos 2 e 3, visou avaliar o efeito das técnicas e solventes de extração no rendimento e atividade biológica das espécies em estudo. Existem várias técnicas disponíveis para a extração de compostos vegetais as quais têm que ser adaptadas aos metabolitos de interesse. Neste trabalho a fração volátil foi obtida por hidrodestilação e extração por fluidos supercríticos, e os compostos fenólicos foram extraídos por maceração, infusão e soxhlet. Para além do material vegetal colhido no habitat natural, foram também utilizadas culturas in vitro de L. viridis e T. lotocephalus. Os resultados indicam que a extração por fluidos supercríticos permitiu maiores rendimentos de extração comparativamente à hidrodestilação, e no que diz respeito aos extratos polares, os rendimentos mais elevados foram obtidos usando água e a mistura água:etanol (1:1) como solventes. Recorrendo às técnicas cromatográficas foi possível atestar que os óleos essenciais e a grande maioria dos extratos supercríticos são predominantemente constituídos por monoterpenos oxigenados. Registaram-se diferenças qualitativas e quantitativas na composição dos óleos essenciais e dos extratos supercríticos obtidos no segundo separador (compostos mais voláteis), tendo-se identificado um maior número de compostos por hidrodestilação. Os extratos polares são ricos em ácidos hidroxicinâmicos (ácidos 3-Ocafeoilquínico, 4-O-cafeoilquínico, 5-O-cafeoilquínico, cafeico e rosmarínico) e flavonoides (luteolina, apigenina e pinocembrina), tendo o ácido rosmarínico sido identificado como o composto maioritário na maioria dos extratos, incluindo os obtidos das culturas in vitro. Comparando os materiais vegetais estudados, as condições usadas in vitro foram as mais favoráveis à acumulação de ácido rosmarínico. Atualmente existe um interesse crescente na utilização de antioxidantes naturais, particularmente de origem vegetal, na prevenção e/ou tratamento de algumas patologias. A implicação do stresse oxidativo no progresso da doença de Alzheimer sugere os antioxidantes naturais como potenciais agentes preventivos. A aplicação destes metabolitos ativos é imensa; também na indústria alimentar, e a potencial toxicidade dos antioxidantes sintéticos estimula a sua substituição por antioxidantes naturais. Neste contexto, as espécies vegetais em estudo foram testadas quanto ao seu potencial antioxidante designadamente a capacidade de (a) captar diferentes radicais (ORAC - oxygen radical antioxidant capacity, DPPH - 2,2-diphenyl- 1-picrylhydrazyl e TEAC - Trolox equivalent antioxidant capacity); (b) quelar o ferro e (c) inibir a peroxidação lipídica em homogeneizados de cérebro de ratinho. Os extratos hidroalcoólicos e infusões foram, geralmente, os sequestradores de radicais mais eficientes (Capítulos 2 e 3). No que diz respeito aos extratos supercríticos, a pressão de extração afetou a capacidade dos extratos colhidos no primeiro separador de captar o radical peroxilo, sendo que a atividade mais elevada se verificou com o incremento da pressão. Os extratos aquosos, hidroalcoólicos e infusões foram os mais ativos na quelação do ferro e inibição da peroxidação lipídica. Ambos os materiais vegetais estudados (selvagem e micropropagado) demonstraram capacidade na quelação de ferro e os extratos etanólicos das culturas in vitro foram os mais eficientes na inibição da peroxidação lipídica. A presença de ácidos hidroxicinâmicos e flavonoides nos extratos polares poderá, em parte, justificar a atividade antioxidante observada. O solvente de extração influenciou significativamente a recuperação de compostos com potencial antioxidante, sendo a mistura água:etanol (1:1) a mais adequada para estas espécies. Os óleos essenciais estão entre os compostos mais valiosos produzidos pelas plantas com aplicações que se estendem às mais diversas áreas. Contudo, a baixa solubilidade em sistemas aquosos e a elevada volatilidade são alguns dos fatores que condicionam a sua aplicação. Ao longo dos anos vários sistemas de encapsulação têm sido desenvolvidos para ultrapassar estas limitações, nomeadamente as ciclodextrinas. Estas são particularmente interessantes pelo caráter anfifílico característico, e foram por isso usadas neste estudo como agentes solubilizantes, concretamente, a β-ciclodextrina e hidroxipropil-β-ciclodextrina. Os resultados apresentados no Capítulo 4 indicam que as ciclodextrinas, nomeadamente a hidroxipropil-β- ciclodextrina, produziram um aumento significativo na atividade antioxidante dos óleos essenciais, provavelmente consequência do aumento da solubilidade de alguns compostos menos polares. Para além do aumento da atividade antioxidante, esta manteve-se estável ao longo de trinta dias. A estratégia mais utilizada atualmente no tratamento da doença de Alzheimer compreende a melhoria da função colinérgica que é clinicamente conseguida através do uso de inibidores colinesterásicos. Embora estes fármacos licenciados sejam eficientes na atenuação dos sintomas, apresentam efeitos secundários e não impedem o progresso da doença. Estas limitações representam simultaneamente um grande desafio na pesquisa de novos fármacos, e foi com este objetivo que neste trabalho as espécies em estudo foram testadas quanto ao potencial anti-colinesterásico (acetilcolinesterase e butirilcolinesterase). Os óleos essenciais apresentaram, geralmente, as inibições mais promissoras, juntamente com o extrato metanólico de L. viridis, que foi também ativo na inibição enzimática in vivo. A atividade anti-colinesterásica dos óleos essenciais poderá refletir a presença de compostos como 1,8- cineol, α-pineno, mirtenal e viridiflorol. No entanto, é de salientar que a atividade biológica de misturas complexas, como os óleos essenciais e extratos, poderá resultar do somatório das atividades individuais dos seus constituintes, e também da presença de efeitos de sinergismo e antagonismo. Relativamente aos extratos supercríticos, apenas os obtidos no primeiro separador apresentaram inicialmente atividade inibitória; contudo, a indicação da presença de falsos positivos sugere que estes resultados poderão estar sobrestimados. L. viridis foi a espécie mais consistente e promissora em termos de atividade biológica. Os compostos bioativos desta espécie são antioxidantes naturais capazes de atuar como sequestradores de radicais livres, agentes quelantes de metais e inibidores da peroxidação lipídica. Além disso, combinam várias formas de prevenção de doenças multifatorais como a doença de Alzheimer, agindo também como inibidores colinesterásicos. Por estas razões, apenas esta espécie foi testada nos ensaios de neuroproteção (Capítulo 5) e digestão in vitro (Capítulo 6). Os extratos de L. viridis e o seu composto predominante, o ácido rosmarínico, protegeram as células A172 dos efeitos negativos gerados pelo peróxido de hidrogénio. Todos os extratos, com exceção do extrato metanólico na concentração mais baixa, e o ácido rosmarínico atenuaram a neurotoxicidade induzida pelo peróxido de hidrogénio. Além disso, o extrato hidroalcoólico, infusão, e o ácido rosmarínico reduziram a acumulação intracelular de espécies reativas de oxigénio. A capacidade de eliminar radicais livres previamente demonstrada explica, em parte, o efeito protetor observado. A presença de compostos com potencial biológico em determinadas espécies, como no caso de L. viridis, por si só não é garantia de que após o seu consumo continuem ativos no momento em que alcançam os tecidos-alvo; é essencial que estes estejam biodisponíveis. Neste sentido, os extratos mais promissores de L. viridis foram submetidos a condições de digestão in vitro, e as atividades antioxidante e anti-colinesterásica dos extratos metabolizados avaliada (Capítulo 6). O ácido rosmarínico puro foi também estudado para averiguar a influência da matriz vegetal na biodisponibilidade dos compostos. Efetivamente, a matriz do extrato metanólico não influenciou a digestão de ácido rosmarínico, ao contrário do hidroalcoólico que protegeu o composto maioritário da digestão ácida. Estes resultados corroboram a influência da matriz vegetal na biodisponibilidade dos seus constituintes. A atividade antioxidante do extrato metanólico e ácido rosmarínico puro foi assegurada depois dos processos digestivos in vitro. No que respeita à atividade anti-colinesterásica dos extratos metabolizados, apenas a inibição da butirilcolinesterase foi afetada. Estes resultados sugerem que os extratos de L. viridis atravessam o trato gastrointestinal sem comprometer grandemente a sua atividade biológica. Esta tese proporcionou um conhecimento mais alargado da composição química e da atividade biológica das espécies L. viridis, L. pedunculata subsp. lusitanica e T. lotocephalus utilizadas tradicionalmente. Todas as espécies, em particular L. viridis, são ricas em antioxidantes e anti-colinesterásicos naturais capazes de participar ativamente na prevenção e/ou tratamento da doença de Alzheimer, ou outras patologias associadas ao stresse oxidativo. Além disso, L. viridis e T. lotocephalus sintetizam compostos bioativos in vitro representando uma alternativa eficiente à obtenção de metabolitos de elevado valor.
A doença de Alzheimer é uma doença neurodegenerativa caracterizada pela deterioração progressiva e irreversível de diversas faculdades cognitivas e que afeta cerca de 35,6 milhões de pessoas em todo o mundo. Até ao momento, a doença permanece sem cura. A terapia disponível concentra-se apenas na atenuação dos sintomas característicos e a complexidade da patogénese constitui um obstáculo para o desenvolvimento de novos fármacos. Para além do défice progressivo e irreversível do sistema colinérgico, são claras as evidências do envolvimento do stresse oxidativo na doença. As plantas produzem compostos com interesse medicinal, e são uma fonte infindável de compostos biologicamente ativos. A Flora Portuguesa é, neste sentido, particularmente interessante pela sua riqueza em espécies aromáticas e medicinais. Esta tese pretende contribuir para a pesquisa de compostos biologicamente ativos a partir das seguintes espécies aromáticas de Portugal: Lavandula viridis L’Hér, Lavandula pedunculata subsp. lusitanica (Chaytor) Franco e Thymus lotocephalus G. López & R. Morales. Estas espécies são usadas como condimentos ou para fins terapêuticos na medicina tradicional, no entanto, o seu potencial biológico ainda não foi totalmente explorado. A primeira fase deste trabalho, descrita nos Capítulos 2 e 3, visou avaliar o efeito das técnicas e solventes de extração no rendimento e atividade biológica das espécies em estudo. Existem várias técnicas disponíveis para a extração de compostos vegetais as quais têm que ser adaptadas aos metabolitos de interesse. Neste trabalho a fração volátil foi obtida por hidrodestilação e extração por fluidos supercríticos, e os compostos fenólicos foram extraídos por maceração, infusão e soxhlet. Para além do material vegetal colhido no habitat natural, foram também utilizadas culturas in vitro de L. viridis e T. lotocephalus. Os resultados indicam que a extração por fluidos supercríticos permitiu maiores rendimentos de extração comparativamente à hidrodestilação, e no que diz respeito aos extratos polares, os rendimentos mais elevados foram obtidos usando água e a mistura água:etanol (1:1) como solventes. Recorrendo às técnicas cromatográficas foi possível atestar que os óleos essenciais e a grande maioria dos extratos supercríticos são predominantemente constituídos por monoterpenos oxigenados. Registaram-se diferenças qualitativas e quantitativas na composição dos óleos essenciais e dos extratos supercríticos obtidos no segundo separador (compostos mais voláteis), tendo-se identificado um maior número de compostos por hidrodestilação. Os extratos polares são ricos em ácidos hidroxicinâmicos (ácidos 3-Ocafeoilquínico, 4-O-cafeoilquínico, 5-O-cafeoilquínico, cafeico e rosmarínico) e flavonoides (luteolina, apigenina e pinocembrina), tendo o ácido rosmarínico sido identificado como o composto maioritário na maioria dos extratos, incluindo os obtidos das culturas in vitro. Comparando os materiais vegetais estudados, as condições usadas in vitro foram as mais favoráveis à acumulação de ácido rosmarínico. Atualmente existe um interesse crescente na utilização de antioxidantes naturais, particularmente de origem vegetal, na prevenção e/ou tratamento de algumas patologias. A implicação do stresse oxidativo no progresso da doença de Alzheimer sugere os antioxidantes naturais como potenciais agentes preventivos. A aplicação destes metabolitos ativos é imensa; também na indústria alimentar, e a potencial toxicidade dos antioxidantes sintéticos estimula a sua substituição por antioxidantes naturais. Neste contexto, as espécies vegetais em estudo foram testadas quanto ao seu potencial antioxidante designadamente a capacidade de (a) captar diferentes radicais (ORAC - oxygen radical antioxidant capacity, DPPH - 2,2-diphenyl- 1-picrylhydrazyl e TEAC - Trolox equivalent antioxidant capacity); (b) quelar o ferro e (c) inibir a peroxidação lipídica em homogeneizados de cérebro de ratinho. Os extratos hidroalcoólicos e infusões foram, geralmente, os sequestradores de radicais mais eficientes (Capítulos 2 e 3). No que diz respeito aos extratos supercríticos, a pressão de extração afetou a capacidade dos extratos colhidos no primeiro separador de captar o radical peroxilo, sendo que a atividade mais elevada se verificou com o incremento da pressão. Os extratos aquosos, hidroalcoólicos e infusões foram os mais ativos na quelação do ferro e inibição da peroxidação lipídica. Ambos os materiais vegetais estudados (selvagem e micropropagado) demonstraram capacidade na quelação de ferro e os extratos etanólicos das culturas in vitro foram os mais eficientes na inibição da peroxidação lipídica. A presença de ácidos hidroxicinâmicos e flavonoides nos extratos polares poderá, em parte, justificar a atividade antioxidante observada. O solvente de extração influenciou significativamente a recuperação de compostos com potencial antioxidante, sendo a mistura água:etanol (1:1) a mais adequada para estas espécies. Os óleos essenciais estão entre os compostos mais valiosos produzidos pelas plantas com aplicações que se estendem às mais diversas áreas. Contudo, a baixa solubilidade em sistemas aquosos e a elevada volatilidade são alguns dos fatores que condicionam a sua aplicação. Ao longo dos anos vários sistemas de encapsulação têm sido desenvolvidos para ultrapassar estas limitações, nomeadamente as ciclodextrinas. Estas são particularmente interessantes pelo caráter anfifílico característico, e foram por isso usadas neste estudo como agentes solubilizantes, concretamente, a β-ciclodextrina e hidroxipropil-β-ciclodextrina. Os resultados apresentados no Capítulo 4 indicam que as ciclodextrinas, nomeadamente a hidroxipropil-β- ciclodextrina, produziram um aumento significativo na atividade antioxidante dos óleos essenciais, provavelmente consequência do aumento da solubilidade de alguns compostos menos polares. Para além do aumento da atividade antioxidante, esta manteve-se estável ao longo de trinta dias. A estratégia mais utilizada atualmente no tratamento da doença de Alzheimer compreende a melhoria da função colinérgica que é clinicamente conseguida através do uso de inibidores colinesterásicos. Embora estes fármacos licenciados sejam eficientes na atenuação dos sintomas, apresentam efeitos secundários e não impedem o progresso da doença. Estas limitações representam simultaneamente um grande desafio na pesquisa de novos fármacos, e foi com este objetivo que neste trabalho as espécies em estudo foram testadas quanto ao potencial anti-colinesterásico (acetilcolinesterase e butirilcolinesterase). Os óleos essenciais apresentaram, geralmente, as inibições mais promissoras, juntamente com o extrato metanólico de L. viridis, que foi também ativo na inibição enzimática in vivo. A atividade anti-colinesterásica dos óleos essenciais poderá refletir a presença de compostos como 1,8- cineol, α-pineno, mirtenal e viridiflorol. No entanto, é de salientar que a atividade biológica de misturas complexas, como os óleos essenciais e extratos, poderá resultar do somatório das atividades individuais dos seus constituintes, e também da presença de efeitos de sinergismo e antagonismo. Relativamente aos extratos supercríticos, apenas os obtidos no primeiro separador apresentaram inicialmente atividade inibitória; contudo, a indicação da presença de falsos positivos sugere que estes resultados poderão estar sobrestimados. L. viridis foi a espécie mais consistente e promissora em termos de atividade biológica. Os compostos bioativos desta espécie são antioxidantes naturais capazes de atuar como sequestradores de radicais livres, agentes quelantes de metais e inibidores da peroxidação lipídica. Além disso, combinam várias formas de prevenção de doenças multifatorais como a doença de Alzheimer, agindo também como inibidores colinesterásicos. Por estas razões, apenas esta espécie foi testada nos ensaios de neuroproteção (Capítulo 5) e digestão in vitro (Capítulo 6). Os extratos de L. viridis e o seu composto predominante, o ácido rosmarínico, protegeram as células A172 dos efeitos negativos gerados pelo peróxido de hidrogénio. Todos os extratos, com exceção do extrato metanólico na concentração mais baixa, e o ácido rosmarínico atenuaram a neurotoxicidade induzida pelo peróxido de hidrogénio. Além disso, o extrato hidroalcoólico, infusão, e o ácido rosmarínico reduziram a acumulação intracelular de espécies reativas de oxigénio. A capacidade de eliminar radicais livres previamente demonstrada explica, em parte, o efeito protetor observado. A presença de compostos com potencial biológico em determinadas espécies, como no caso de L. viridis, por si só não é garantia de que após o seu consumo continuem ativos no momento em que alcançam os tecidos-alvo; é essencial que estes estejam biodisponíveis. Neste sentido, os extratos mais promissores de L. viridis foram submetidos a condições de digestão in vitro, e as atividades antioxidante e anti-colinesterásica dos extratos metabolizados avaliada (Capítulo 6). O ácido rosmarínico puro foi também estudado para averiguar a influência da matriz vegetal na biodisponibilidade dos compostos. Efetivamente, a matriz do extrato metanólico não influenciou a digestão de ácido rosmarínico, ao contrário do hidroalcoólico que protegeu o composto maioritário da digestão ácida. Estes resultados corroboram a influência da matriz vegetal na biodisponibilidade dos seus constituintes. A atividade antioxidante do extrato metanólico e ácido rosmarínico puro foi assegurada depois dos processos digestivos in vitro. No que respeita à atividade anti-colinesterásica dos extratos metabolizados, apenas a inibição da butirilcolinesterase foi afetada. Estes resultados sugerem que os extratos de L. viridis atravessam o trato gastrointestinal sem comprometer grandemente a sua atividade biológica. Esta tese proporcionou um conhecimento mais alargado da composição química e da atividade biológica das espécies L. viridis, L. pedunculata subsp. lusitanica e T. lotocephalus utilizadas tradicionalmente. Todas as espécies, em particular L. viridis, são ricas em antioxidantes e anti-colinesterásicos naturais capazes de participar ativamente na prevenção e/ou tratamento da doença de Alzheimer, ou outras patologias associadas ao stresse oxidativo. Além disso, L. viridis e T. lotocephalus sintetizam compostos bioativos in vitro representando uma alternativa eficiente à obtenção de metabolitos de elevado valor.
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Keywords
Plantas aromáticas Doenças neurológicas Doença de Alzheimer Cultura in vitro Lavandula viridis Lavandula pedunculata Thymus lotocephalus Dieta mediterrânica