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Study of the molecular mechanisms involved in cell differentiation of embryonic stem cells
| Name: | Description: | Size: | Format: | |
|---|---|---|---|---|
| 25.15 MB | Adobe PDF |
Authors
Advisor(s)
Abstract(s)
Potential
heart
progenitors
from
postnatal
and
adult
heart
have
been
identified
in
rodents
and
humans,
and
were
shown
to
differentiate
in
vitro
into
mature
cardiomyocytes.
However,
in
some
studies
only
immature
cardiac
cells
were
obtained,
leading
to
concerns
about
whether
the
inefficient
cell
electrical
maturation
and
electrical
coupling
of
derivative
cells
will
cause
arrhythmias
upon
cellular
therapies
of
injured
hearts.
Notwithstanding
these
concerns,
recent
clinical
assays
have
indicated
an
improvement
of
heart
function
and
life
quality
of
patients
treated
with
autologous
cardiac
progenitor
cells.
With
the
discovery
of
the
capacity
of
embryonic
stem
cells
(ESC)
to
differentiate
into
all
lineages,
including
the
cardiovascular
lineage,
many
researchers
have
been
focusing
on
developing
strategies
to
efficiently
direct
ESC
differentiation
for
the
production
of
unlimited
numbers
of
cardiomyocytes.
Yet,
the
low
efficiency
of
cardiac
differentiation,
its
teratogenic
nature
and
the
lack
of
reliable
protocols
to
purify
the
desired
cells
from
ESC
cultures
are
holding
back
their
use
for
clinical
application.
Hence,
understanding
the
molecular
mechanisms
that
regulate
commitment
and
differentiation
of
diverse
muscle
and
non-‐muscle
cell
lineages
of
the
heart
is
essential
to
improve
current
therapies
and
to
design
novel
heart
stem
cell-‐
based
therapeutic
strategies
for
cardiac
regenerative
medicine.
Many
transcription
factors,
including
Nkx2.5,
Gata4
and
Isl1,
have
been
described
as
master
regulators
of
cardiac
morphogenesis.
Indeed,
they
are
required
for
the
commitment
and
differentiation
of
cardiac
progenitors
in
early
embryonic
development,
as
well
as
for
the
differentiation
of
ESC
into
cardiovascular
lineages.
Furthermore,
mutations
in
these
genes
have
been
associated
with
congenital
heart
defects
in
humans.
This
finding
underscores
the
clinical
relevance
of
studying
the
role
of
cardiac
transcription
factors
during
heart
development.
Cited2
is
a
transcriptional
regulator
essential
for
mouse
embryonic
development.
Amongst
a
wide
spectrum
of
developmental
defects
presented
by
Cited2
knockout
mouse
embryos,
the
cardiovascular
and
left-‐right
patterning
defects
are
the
most
prominent.
Importantly,
heterozygous
mutations
of
human
CITED2
in
association
with
congenital
heart
disease
have
been
reported
by
several
research
groups.
Moreover,
it
has
been
suggested
that
Cited2
is
important
for
ESC-‐derived
cardiovascular development
and
essential
in
the
epiblast
or
its
derivatives
for
normal
cardiac
left-‐right
patterning.
Although
Cited2
was
shown
to
be
required
for
the
maintenance
of
pluripotency
and
self-‐renewal
of
ESC,
its
role
in
early
embryonic
development
and
its
mechanism
of
action
are
still
not
well
explored.
In
the
present
study,
we
investigated
the
role
of
Cited2
in
mouse
ESC
differentiation
towards
cardiac
cells.
By
performing
increasing
and
absence
of
Cited2
expression
in
ESC,
we
have
established
that
Cited2
is
essential
for
cell
commitment
and
differentiation
towards
the
mesoderm,
ectoderm
and
endoderm
lineages.
Indeed,
Cited2
depletion
impaired
ESC
differentiation
to
several
cell
lineages.
More
importantly,
Cited2
was
required
for
the
normal
emergence
of
mesoderm
cells
from
early
ESC
specification
to
cardiac
lineages.
Our
results
suggest
that
this
response
is
primarily
associated
with
the
direct
or
indirect
modulation
of
Nodal
and
Brachyury
gene
expression
during
mesodermal
cell
commitment,
thus
enabling
a
signaling
cascade
promoting
cardiogenesis.
Additionally,
our
results
indicated
that
loss
of
Cited2
generated
comparatively
less
cardiomyocytes
in
differentiated
ESC
cultures,
whereas
gain
of
Cited2
led
to
higher
numbers
of
cardiomyocytes.
These
findings
suggest
Cited2
is
an
important
protein
for
cardiac
function.
Furthermore,
our
data
suggest
that
Cited2
can
modulate
the
gene
expression
(Islet1,
Gata4,
Nkx2.5
and
Tbx5)
in
cardiac
progenitors,
thus
playing
an
important
role
during
cardiac
cell
commitment.
We
have
also
found
that
Cited2
plays
a
role
in
cardiomyocyte
proliferation,
as
indicated
by
the
downregulation
of
Tbx5
and
its
targets
genes
upon
Cited2
depletion.
Furthermore,
by
overexpressing
human
CITED2
and
Gata4
in
murine
ESC,
we
found
that
Cited2
could
not
prevent
endoderm
commitment
induced
by
Gata4
overexpression.
The
same
overexpression
approach
was
used
to
test
the
role
of
CITED2-‐ISLET1
interaction
in
cardiac
differentiation,
and
the
results
indicate
that
the
cardiogenic
response
of
Cited2
might
be
additive
in
association
with
that
induced
by
Islet1
(Isl1)
overexpression.
We
have
also
found
Cited2
expression
in
multipotent
cardiac
progenitor
population,
specifically
in
secondary
heart
field
(SHF)
progenitors,
which
are
marked
by
the
expression
of
Isl1
protein.
Our
data
generated
by
increasing
and
absence
of
Cited2
Cited2
expression
in
SHF
progenitor,
suggest
that
finely
regulated
Cited2
gene
expression
levels
could
allow
or
disrupt
the
SHF-‐differentiation
program.
Moreover,
by
performing
GST-‐pull
down
and
by
bi-‐molecular
fluorescence
complementation
assays,
we
gathered
evidence
indicating
that
CITED2
physically
interacts
with
ISL1.
By performing
chromatin
immunoprecipitation
assays
we
have
also
found
that
CITED2
binds
the
Isl1
promoter
region.
Taken
together,
our
results
indicate
that
Cited2
is
important
for
proper
cardiovascular
differentiation
by
acting
at
different
levels
during
cardiac
stem
cell
commitment:
firstly,
by
inducing
ESC
towards
mesoderm
at
early
events
during
ESC
commitment;
and
secondly,
by
inducing
and
maintaining
the
expression
of
cardiac
transcription
factors
important
for
cardiogenesis.
Although
many
Cited2
functions
remain
uncovered,
our
data
indicate
that
Cited2
is
an
important
cardiac
differentiation
regulator
that
can
participate
in
heart
regeneration,
and
therefore
be
useful
for
the
development
of
alternative
approaches
to
treat
or
prevent
heart
failure,
Potenciais progenitores cardíacos de coração pós-‐natal e adulto foram identificados em roedores e seres humanos, e verificou-‐se serem capazes de se diferenciar in vitro em cardiomiócitos maduros. No entanto, em alguns estudos foram obtidos apenas células cardíacas imaturas, assim suscitando questões sobre se ineficiente maturação elétrica celular e acoplamento eléctrico das células derivadas não causará arritmias no contexto da aplicação de terapias celulares em lesões cardíacas. Apesar destas questões, ensaios clínicos recentes indicaram uma melhoria da função cardíaca e da qualidade de vida dos pacientes tratados com células progenitoras cardíacas autólogas. Com a descoberta da capacidade de células estaminais embrionárias (ESC) se diferenciarem em todas as linhagens, incluindo a linhagem cardiovascular, muitos investigadores se têm concentrado no desenvolvimento de estratégias para dirigir eficientemente a diferenciação de ESC para a produção de um número ilimitado de cardiomiócitos. No entanto, a baixa eficiência da diferenciação cardíaca, a sua natureza teratogénica e a falta de protocolos bem validados para purificar as células desejadas das culturas de ESC estão a atrasar o seu uso para aplicações clínicas. Assim, a compreensão dos mecanismos moleculares que regulam o comprometimento e diferenciação de diversas linhagens de células musculares e não-‐ musculares do coração é essencial para melhorar as terapias atuais e para conceber novas estratégias terapêuticas baseadas em células estaminais para a medicina regenerativa cardíaca. Muitos factores de transcrição, incluindo Nkx2.5, Gata4 e ISL1, têm sido descritos como reguladores importantes da morfogénese cardíaca. Com efeito, eles são necessários para o comprometimento e diferenciação de células progenitoras cardíacas no desenvolvimento embrionário inicial, assim como para a diferenciação das ESC em linhagens cardiovasculares. Além disso, mutações nestes genes foram associadas a doenças cardíacas congénitas em pacientes humanos. Esta observação reforça a relevância clínica do estudo do papel dos fatores de transcrição cardíacos no desenvolvimento do coração. O Cited2 é um regulador de transcrição essencial para o desenvolvimento embrionário murino. Entre um amplo espetro de defeitos de desenvolvimento apresentados por embriões de ratinho Cited2 knockout, defeitos cardiovasculares e de padronização esquerda-‐direita são os mais proeminentes. É importante ressaltar que mutações heterozigóticas de CITED2 humano em associação com cardiopatias congénitas têm sido relatados por vários grupos de investigação. Além disso, tem sido sugerido que Cited2 é importante para o desenvolvimento cardiovascular derivado de ESC e é essencial no epiblasto ou seus derivados para a padronização esquerda-‐direita cardíaca. Embora o Cited2 seja necessário para a manutenção da pluripotência e auto-‐ renovação de ESC, o seu papel no desenvolvimento embrionário precoce e o seu mecanismo de ação ainda não foram bem explorados. No presente estudo, investigamos o papel de Cited2 em diferenciação de ESC de ratinho em células cardíacas. Através da realização de experiências de ganho e de perda de função de Cited2 em ESC, nós verificámos que Cited2 é essencial para o comprometimento e diferenciação em células de linhagens de mesoderme, ectoderme e endoderme. De facto, a depleção de Cited2 perturbou a diferenciação de ESC para diversas linhagens de células. Mais importante ainda, Cited2 foi necessário para o aparecimento normal de células da mesoderme a partir da especificação precoce de ESC para linhagens cardíacas. Os nossos resultados sugerem que esta resposta está principalmente associada com a modulação direta ou indireta da expressão dos genes Nodal e Brachyury durante o comprometimento em célula mesodermal, permitindo assim uma cascata de sinalização que promove a cardiogénese. Além disso, os nossos resultados indicam que a perda de Cited2 levou à geração de menos cardiomiócitos em culturas de ESC diferenciadas, enquanto que o ganho de Cited2 levou a um maior número de cardiomiócitos. Estes resultados sugerem portanto que Cited2 é uma proteína importante para a função cardíaca. Além disso, nossos dados sugerem que Cited2 pode modular a expressão génica (Islet1, Gata4, Nkx2.5 e Tbx5) em progenitores cardíacos, desempenhando assim um papel importante durante o comprometimento de células cardíacas. Nós também descobrimos que Cited2 desempenha um papel na proliferação de cardiomiócitos, como indicado pela regulação negativa de Tbx5 e seus genes-‐alvo na situação de depleção de Cited2. Além disso, através de sobreexpressão de CITED2 humano e Gata4 em ESC, descobrimos que Cited2 não impede o comprometimento em endoderme induzido pela sobreexpressão de Gata4. A mesma abordagem de sobre-‐expressão foi usada para testar o papel da interação CITED2-‐ ISLET1 na diferenciação cardíaca, e os resultados indicam que a resposta cardiogénica de Cited2 será aditiva em associação com aquela induzida pela sobreexpressão de Islet1 (ISL1). Também detetámos expressão de Cited2 em populações de progenitores cardíacos multipotentes, especificamente em progenitores do campo cardíaco secundário (SHF), que são marcados pela expressão da proteína ISL1. Os nossos dados obtidos em experiências de ganho e perda da função de Cited2 em progenitores SHF sugerem que níveis de expressão do gene Cited2 finamente regulados podem permitir ou interromper o programa de diferenciação SHF. Além disso, através da realização de ensaios de GST-‐pull down e ensaios de fluorescência de complementação bi-‐molecular, obtivemos dados indicando que CITED2 interage fisicamente com ISL1. Através da realização de ensaios de imunoprecipitação de cromatina também descobrimos que CITED2 se liga à região do promotor de ISL1. Em conjunto, os nossos resultados indicam que Cited2 é importante para uma diferenciação cardiovascular adequada, agindo em diferentes níveis durante o comprometimento de células estaminais cardíacas: em primeiro lugar através da indução de ESC para mesoderme em estadios precoces durante o comprometimento de ESC; e em segundo lugar através da indução e manutenção da expressão de fatores de transcrição cardíacos importantes para a cardiogénese. Embora muitas funções de Cited2 permaneçam por descobrir, os nossos dados indicam que Cited2 é um importante regulador da diferenciação cardíaca, que pode participar na regeneração do coração e, portanto, ser útil para o desenvolvimento de abordagens alternativas para o tratamento ou prevenção da insuficiência cardíaca.
Potenciais progenitores cardíacos de coração pós-‐natal e adulto foram identificados em roedores e seres humanos, e verificou-‐se serem capazes de se diferenciar in vitro em cardiomiócitos maduros. No entanto, em alguns estudos foram obtidos apenas células cardíacas imaturas, assim suscitando questões sobre se ineficiente maturação elétrica celular e acoplamento eléctrico das células derivadas não causará arritmias no contexto da aplicação de terapias celulares em lesões cardíacas. Apesar destas questões, ensaios clínicos recentes indicaram uma melhoria da função cardíaca e da qualidade de vida dos pacientes tratados com células progenitoras cardíacas autólogas. Com a descoberta da capacidade de células estaminais embrionárias (ESC) se diferenciarem em todas as linhagens, incluindo a linhagem cardiovascular, muitos investigadores se têm concentrado no desenvolvimento de estratégias para dirigir eficientemente a diferenciação de ESC para a produção de um número ilimitado de cardiomiócitos. No entanto, a baixa eficiência da diferenciação cardíaca, a sua natureza teratogénica e a falta de protocolos bem validados para purificar as células desejadas das culturas de ESC estão a atrasar o seu uso para aplicações clínicas. Assim, a compreensão dos mecanismos moleculares que regulam o comprometimento e diferenciação de diversas linhagens de células musculares e não-‐ musculares do coração é essencial para melhorar as terapias atuais e para conceber novas estratégias terapêuticas baseadas em células estaminais para a medicina regenerativa cardíaca. Muitos factores de transcrição, incluindo Nkx2.5, Gata4 e ISL1, têm sido descritos como reguladores importantes da morfogénese cardíaca. Com efeito, eles são necessários para o comprometimento e diferenciação de células progenitoras cardíacas no desenvolvimento embrionário inicial, assim como para a diferenciação das ESC em linhagens cardiovasculares. Além disso, mutações nestes genes foram associadas a doenças cardíacas congénitas em pacientes humanos. Esta observação reforça a relevância clínica do estudo do papel dos fatores de transcrição cardíacos no desenvolvimento do coração. O Cited2 é um regulador de transcrição essencial para o desenvolvimento embrionário murino. Entre um amplo espetro de defeitos de desenvolvimento apresentados por embriões de ratinho Cited2 knockout, defeitos cardiovasculares e de padronização esquerda-‐direita são os mais proeminentes. É importante ressaltar que mutações heterozigóticas de CITED2 humano em associação com cardiopatias congénitas têm sido relatados por vários grupos de investigação. Além disso, tem sido sugerido que Cited2 é importante para o desenvolvimento cardiovascular derivado de ESC e é essencial no epiblasto ou seus derivados para a padronização esquerda-‐direita cardíaca. Embora o Cited2 seja necessário para a manutenção da pluripotência e auto-‐ renovação de ESC, o seu papel no desenvolvimento embrionário precoce e o seu mecanismo de ação ainda não foram bem explorados. No presente estudo, investigamos o papel de Cited2 em diferenciação de ESC de ratinho em células cardíacas. Através da realização de experiências de ganho e de perda de função de Cited2 em ESC, nós verificámos que Cited2 é essencial para o comprometimento e diferenciação em células de linhagens de mesoderme, ectoderme e endoderme. De facto, a depleção de Cited2 perturbou a diferenciação de ESC para diversas linhagens de células. Mais importante ainda, Cited2 foi necessário para o aparecimento normal de células da mesoderme a partir da especificação precoce de ESC para linhagens cardíacas. Os nossos resultados sugerem que esta resposta está principalmente associada com a modulação direta ou indireta da expressão dos genes Nodal e Brachyury durante o comprometimento em célula mesodermal, permitindo assim uma cascata de sinalização que promove a cardiogénese. Além disso, os nossos resultados indicam que a perda de Cited2 levou à geração de menos cardiomiócitos em culturas de ESC diferenciadas, enquanto que o ganho de Cited2 levou a um maior número de cardiomiócitos. Estes resultados sugerem portanto que Cited2 é uma proteína importante para a função cardíaca. Além disso, nossos dados sugerem que Cited2 pode modular a expressão génica (Islet1, Gata4, Nkx2.5 e Tbx5) em progenitores cardíacos, desempenhando assim um papel importante durante o comprometimento de células cardíacas. Nós também descobrimos que Cited2 desempenha um papel na proliferação de cardiomiócitos, como indicado pela regulação negativa de Tbx5 e seus genes-‐alvo na situação de depleção de Cited2. Além disso, através de sobreexpressão de CITED2 humano e Gata4 em ESC, descobrimos que Cited2 não impede o comprometimento em endoderme induzido pela sobreexpressão de Gata4. A mesma abordagem de sobre-‐expressão foi usada para testar o papel da interação CITED2-‐ ISLET1 na diferenciação cardíaca, e os resultados indicam que a resposta cardiogénica de Cited2 será aditiva em associação com aquela induzida pela sobreexpressão de Islet1 (ISL1). Também detetámos expressão de Cited2 em populações de progenitores cardíacos multipotentes, especificamente em progenitores do campo cardíaco secundário (SHF), que são marcados pela expressão da proteína ISL1. Os nossos dados obtidos em experiências de ganho e perda da função de Cited2 em progenitores SHF sugerem que níveis de expressão do gene Cited2 finamente regulados podem permitir ou interromper o programa de diferenciação SHF. Além disso, através da realização de ensaios de GST-‐pull down e ensaios de fluorescência de complementação bi-‐molecular, obtivemos dados indicando que CITED2 interage fisicamente com ISL1. Através da realização de ensaios de imunoprecipitação de cromatina também descobrimos que CITED2 se liga à região do promotor de ISL1. Em conjunto, os nossos resultados indicam que Cited2 é importante para uma diferenciação cardiovascular adequada, agindo em diferentes níveis durante o comprometimento de células estaminais cardíacas: em primeiro lugar através da indução de ESC para mesoderme em estadios precoces durante o comprometimento de ESC; e em segundo lugar através da indução e manutenção da expressão de fatores de transcrição cardíacos importantes para a cardiogénese. Embora muitas funções de Cited2 permaneçam por descobrir, os nossos dados indicam que Cited2 é um importante regulador da diferenciação cardíaca, que pode participar na regeneração do coração e, portanto, ser útil para o desenvolvimento de abordagens alternativas para o tratamento ou prevenção da insuficiência cardíaca.
Description
Keywords
Ciências biomédicas Coração Desenvolvimento embrionário Células estaminais embrionárias Insuficiência cardíaca Regeneração