Utilize este identificador para referenciar este registo: http://hdl.handle.net/10400.1/369
Título: Bacillus subtilis 168 Carboxylesterase A: characterization and selection of improved variants towards IPG-C4
Autor: Rodrigues, Susana
Orientador: Quax, Wim. J.
Godinho, Luís
Melo, Eduardo
Palavras-chave: Teses
Enzimas
Bacillus subtilis
Selecção genética
Enantioselectividade
577
Data de Defesa: 2009
Resumo: Enzymes had become an attractive tool for the kinetic resolution of racemic mixtures for the enantiopure production of chiral pharmaceuticals. Sometimes the existing enzymes are not suitable for the desired process which led to the development of directed evolution. In directed evolution experiments, success strongly depends on the availability of genetic screening or selection methods. However enantioselectivity is a difficult parameter to select for. In 2008 Boersma, et al. had developed a new selection system based on bacterial growth that not only selects for catalytic activity but also for enantioselectivity. Despite of having been used with Bacillus subtilis 168 Lipase A (LipA) the author suggests that other enzymes could be applied to the method. Growth selection designed for LipA were applied to Bacillus subtilis 168 Carboxilesterase A (CesA), despite of the low activity of CesA to the substrate that led to a longer incubation time (4 days instead of 2), and false positives of about 25 % the method seems to work and some enantioselective mutants were obtained. The preliminary studies in the gas chromatography (GC) analysis of the periplasm fraction of some mutants revealed that the enantioselectivity had increased to the desired enantiomer, R-1,2-O-isopropilideno-sn-glicerol-butyrate. Despite of this work was a preliminary study the results showed that the developed method of selection system based on bacterial growth, designed for LipA, can be performed with other enzymes. In the present work it was obtained high values for the first round of screening, enantiomeric excess values (ee) around 60%.
Os enzimas tornaram-se uma ferramenta atractiva para a resolução cinética de misturas racêmicas para a produção de fármacos quirais enantiopuros. Por vezes os enzimas existentes não são adequados para o processo desejado, o que levou ao desenvolvimento da evolução dirigida. Nas experiencias de evolução dirigida, o sucesso depende fortemente da disponibilidade de métodos de triagem ou selecção genética. Contudo a enantioseletividade é um parâmetro difícil de seleccionar. Em 2008, Boersma, et al. desenvolveu um novo sistema de selecção baseado no crescimento de bactérias que não só selecciona pela actividade catalítica, mas também pela enantioseletividade. Embora tenha sido utilizado em Bacillus subtilis 168 Lipase A (LipA) os autores sugerem que outros enzimas poderiam ser aplicados ao método. O growth selection devenvolvido para a selecção da LipA foi aplicado a Bacillus subtilis 168 Carboxilesterase A (CesA), apesar da baixa actividade da CesA para com o substrato, o que levou a um maior tempo de incubação (4 dias em vez de 2), e ao aparecimento de cerca de 25% de falsos positivos. Os estudos preliminares na análise por cromatografia gasosa da fracção do periplasma de alguns mutantes revelaram que a enantioseletividade tinha aumentado para o enantiômero desejado, R-1,2-O-isopropilideno-sn-glicerol-butirato. Apesar de este ser apenas um estudo preliminar, mostrou indícios de que o método desenvolvido pode ser utilizado com outros enzimas. Apresentando, neste caso valores elevados para o primeiro round de selecção, valores de excesso enantiomérico (ee) de cerca de 60%.
Descrição: Dissertação mest. , Engenharia Biológica, Universidade do Algarve, 2010
URI: http://hdl.handle.net/10400.1/369
Designação: Mestrado em Engenharia Biológica
Aparece nas colecções:FCT1-Teses
UA01-Teses



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