Ferreira, Bibiana I.Link, WolfgangGrenho, Inês Filipa Acácio2023-06-292021-11-05http://hdl.handle.net/10400.1/19776Pancreatic cancer (PC) is among the most aggressive cancers in the world, characterized by an extremely high mortality/incidence ratio. Besides its aggressiveness, PC is usually diagnosed in an advanced and metastatic stage, which limits the treatment options available. Most of these tumors are unresectable by surgery, thus chemotherapy remains the only option available for treatment. However, a majority of these patients relapse within months and have a recurrence of the disease, usually more aggressive and no longer sensitive to the initial treatment. The major responsible for this relapse is the development of acquired therapy resistance. Our work focused on generating cell lines resistant to the current first line chemotherapy drug, Gemcitabine, and on their characterization. This allowed us to generate tools that will be crucial to unveil the mechanism driving acquired resistance in PC. Previous studies from our group and others demonstrated an association between the expression profiles of TRIBBLES pseudokinases and drug resistant phenotypes in other cancers. We evaluated the sensitivity of the generated cell lines to Gemcitabine and characterized them in terms of migration ability, cell death rate under stress and the expression of TRIBBLES proteins and EMT markers. Our results show that we successfully generated Gemcitabine-resistant cell lines, and that these cell lines are phenotypically different from the sensitive ones, showing fibroblastic-like features. Furthermore, we observed a reversible phenotypic switch when these cells undergo Gemcitabine treatment. They show different migration ability and increased mRNA expression of EMT markers, a hallmark of the epithelial-to-mesenchymal transition process. Moreover, in the resistant cells we observed higher TRIB2 protein expression levels and a decrease in the TRIB3 protein expression, compared with the sensitive cell lines. Overall, the phenotype associated with the resistant cells is concordant with drug resistance development by chronic Gemcitabine exposure.Cancro, ou neoplasias malignas, é um conjunto de doenças que afetam a população mundial veemente de uma forma recorrente. Atualmente, estas doenças contam com uma crescente incidência e representam a causa de grande percentagem da mortalidade a nível mundial. O cancro pancreático encontra-se em 14º lugar como o tipo de cancro mais diagnosticado nos últimos tempos, e representa o 7º cancro mais mortífero. De acordo com os dados mais recentes, possui um rácio de mortalidade/incidência de 94%. Para além da sua agressividade, o cancro pancreático é usualmente diagnosticado em fases tardias do seu desenvolvimento. Cerca de 52% destes tumores são detetados em estado avançado ou com presença de metástases, o que contribui para um desvantajoso prognóstico destes pacientes. Em causa estão a falta de sintomas em fases precoces do desenvolvimento deste tumor e a escassez de novos e específicos biomarcadores. As opções de tratamento disponíveis para o cancro pancreático estão correlacionadas com o estádio do tumor na altura do diagnóstico. Relativamente aos tumores metastáticos, a primeira linha de tratamento baseia-se em protocolos de quimioterapia. No geral, seja em terapias adjuvantes ou neoadjuvantes ou em tratamentos de primeira linha com quimioterapia, o fármaco Gemcitabina está recorrentemente presente no tratamento de pacientes com cancro do pâncreas. A Gemcitabina (2’,2’-difluoro-2’-deoxycytidin; dFdC) é um análogo de nucleósidos, frequentemente utilizado no tratamento do cancro do pâncreas, mas também no tratamento de cancro da mama, ovário, bexiga, e pulmão de células não pequenas. O mecanismo de ação principal da Gemcitabina baseia-se na inibição da síntese de DNA, atuando na fase S do ciclo celular. A sua forma ativa e trifosfatada, dFdCTP, compete com os nucleótidos e é incorporada na cadeia, impedindo a elongação da cadeia de DNA e mimetizando a sua terminação. Para além disso, a Gemcitabina é também reconhecida por conseguir auto potenciar a sua ação e por induzir o processo de apoptose, por ativação da enzima quinase p38-MAPK, em células tumorais e pela via de sinalização AMPK/mTOR. Contudo, apesar do desenvolvimento das terapias, a percentagem de sobrevivência destes pacientes ao fim de 5 anos continua diminuta. A taxa de sobrevivência varia de 39% para pacientes com tumores ressecáveis ou locais (11%), para 3% em tumores avançados ou metastáticos (52%). Para além disso, a taxa de progressão livre de desenvolvimento da doença apenas se mantém na ordem dos meses. Ensaios clínicos em pacientes com doença avançada demonstram que a maioria apresenta uma recaída da doença em apenas 2 a 6 meses após tratamento. O desenvolvimento de resistência à terapia é um dos principais fatores associados ao mau prognóstico do cancro pancreático. Apesar de detetado tardiamente, a maioria dos pacientes submetidos a tratamento acabam por sofrer uma recaída, com evolução de um tumor mais agressivo e não sensível às terapias previamente administradas. Contudo, os mecanismos desta resistência adquirida são ainda pouco conhecidos, sendo a maioria dos já descritos considerados intrínsecos. O presente projeto baseia-se na criação de um modelo celular pancreático resistente à Gemcitabina. O principal objetivo foca-se no desenvolvimento de ferramentas essenciais para a investigação de mecanismos de resistência adquirida. De forma a gerar o modelo resistente, selecionámos duas linhas celulares descritas como sensíveis à Gemcitabina, MIA PaCa-2 e PANC-1. Através de exposição crónica ao fármaco, por administração de ciclos consecutivos de tratamento gerámos três linhas celulares, MUTIR28, MUTIR01 e PUTIR23. A caracterização das linhas celulares resistentes é crucial para futuramente compreender os mecanismos que conduzem a esta resistência. Desta forma, avaliámos os níveis de resistência das linhas celulares geradas, pela avaliação dos valores de IC50 (metade da concentração inibitória máxima) correspondentes. De acordo com a definição de resistência, este valor deve ser duas vezes superior ao da linha celular sensível correspondente. Considerando este princípio, apesar de todas as linhas celulares mostraram aumento dos seus valores de IC50, apenas as linhas MUTIR28 e PUTIR23 são resistentes. Ao longo deste trabalho referimo-nos às três linhas como resistentes, de forma a melhor serem identificadas em comparação com as parentais. Durante o protocolo de tratamentos com a Gemcitabina para gerar as novas linhas, observámos uma mudança de fenótipo por parte das células expostas ao fármaco. A linha celular parental apresenta uma morfologia epitelial, com adesões entre as células, que apresentam conformação quadrangular. Contudo, as células resistentes, quando submetidas a um novo ciclo de tratamento, perdem aderência, encontrando-se em suspensão e aderindo tardiamente à superfície de cultura (com características fusiformes). Desta forma, avaliámos os níveis de marcadores de EMT nas células que sofreram esta alteração fenotípica e observámos um padrão de aumento dos níveis dos marcadores mesenquimais, relativamente às linhas celulares parentais. As células foram também caracterizadas relativamente à sua capacidade de migração. Surpreendentemente, as linhas derivadas de MIA PaCa-2 apresentam níveis inferiores de migração quando comparado com a linha sensível. Relativamente à linha derivada de PANC-1, esta apresenta níveis superiores quando comparados com a linha parental. Após a criação das linhas, caracterizámos a sua viabilidade e níveis de morte celular quando expostas a uma concentração específica do fármaco. Para tal, as células foram tratadas com a concentração de Gemcitabina correspondente ao IC50 das células parentais e executámos ensaios de viabilidade (ensaio de viabilidade MTT) e morte celular (ensaio de exclusão de Trypan Blue). Como observado, as linhas derivadas de MIA PaCa-2 demonstram alterações nos níveis de morte (induzida por Gemcitabina) e viabilidade comparadas com a linha parental. Contudo, o mesmo não acontece para PUTIR23 comparando com a linha sensível PANC-1, quando tratadas com baixas concentrações de Gemcitabina. Por fim, caracterizámos as linhas resistentes relativamente à expressão de proteínas TRIBBLES. Alguns trabalhos anteriores demonstraram uma associação entre os níveis de TRIB2 e de TRIB3 e os fenótipos resistentes em outros tipos de cancro. Desta forma, considerámos importante avaliar se estas proteínas são possíveis alvos na resistência desenvolvida no cancro pancreático. Através de uma avaliação aos níveis transcricionais e proteicos, observámos um aumento de TRIB2 nas linhas resistentes e um decréscimo na expressão de TRIB3. De uma forma geral, o fenótipo associado às linhas resistentes é concordante com o desenvolvimento de resistência por exposição crónica à Gemcitabina, tal como sucede na clínica.engPancreatic cancerGemcitabineDrug-resistanceResistance mechanismsTRIB2TRIB3master thesis202807916