Matos, CarlosNóbrega, ClévioReis, Ricardo António Afonso2021-06-022023-12-102020-12-10http://hdl.handle.net/10400.1/15533Spinocerebellar ataxia type 2 (SCA2) is a hereditary neurodegenerative disorder caused by expansion of CAG trinucleotide repeats present in the codifying region of the ATXN2 gene. The mutant ATXN2 product - a ataxin-2 protein with an expanded polyglutamine tract - displays a cytotoxic gain-of-function, leading to progressive neurodegeneration. No definitive therapy for this disease has yet been developed, but ATXN2 knock-down represents a promising approach. The versatility of the CRISPR-Cas system enables gene silencing at a genomic level, through an array of unprecedently diverse mechanisms. Cas nucleases guided by a single guide RNA (sgRNA) molecule produce modifications in precise regions of the DNA, and the system can be modified to direct transcriptional inhibitors such as the Krüppel-associated box domain (KRAB) to particular genetic loci. The aim of this study was to develop two ATXN2 silencing strategies, utilizing catalytically active Cas9 to knock-down the ATXN2 gene or, alternatively, a dCas9-KRAB fusion protein to pre-transcriptionally repress ATXN2 expression. One sgRNA targeting the codifying region of ATXN2 was cloned into a plasmid encoding Cas9, and another sgRNA targeting the ATXN2 promoter was cloned into a plasmid encoding dCas9-KRAB. Plasmids were transfected into human embryonic kidney (HEK) 293T cells and endogenous ATXN2 mRNA and protein levels were analyzed by qPCR and Western blot. Cas9/sgRNA did not alter ATXN2 mRNA levels in comparison to controls, contrasting with ataxin-2 protein levels that revealed a decrease tendency. dCas9-KRAB/sgRNA did not alter ATXN2 mRNA levels, but displayed a tendency for decreasing ataxin-2 protein levels, relative to non-transfected cells. Our study suggests that the CRISPR-Cas9 system may be adapted for ATXN2 gene silencing applications, but further improvements to our strategies will be necessary to produce significant alterations.De entre as diferentes formas hereditárias de ataxia, a ataxia espinocerebelosa tipo 2 representa a segunda mais comum a nível mundial. Os sintomas progressivos desta doença neurodegenerativa incluem perda de coordenação motora, movimentos sacádicos oculares e vários sinais resultantes de degeneração cerebelosa, como disartria e disfagia. A ataxia espinocerebelosa tipo 2 surge como consequência de uma expansão anormal de repetições de trinucleótidos CAG presentes no exão 1 do gene ATXN2, em número igual ou superior a 33. O gene ATXN2 codifica a proteína ataxina-2 e, na sua forma mutada, origina uma forma alterada desta proteína, com uma sequência de glutaminas anormalmente expandida. Esta expansão confere à proteína propriedades citotóxicas, responsáveis pela disfunção e morte de populações particulares de neurónios, nomeadamente as células de Purkinje. Com efeito, a ataxia espinocerebelosa tipo 2 insere-se no grupo das doenças de poliglutaminas, um conjunto de nove doenças neurodegenerativas monogénicas que têm em comum o facto de serem causadas por expansões de repetições de glutaminas nas proteínas a que estão associadas. Recentemente, estudos têm sugerido que tratos de CAG expandidos presentes em transcritos de mRNA podem também apresentar toxicidade e contribuir para os mecanismos fisiopatológicos. Até aos dias de hoje, não foi ainda desenvolvida nenhuma terapia eficaz para a ataxia espincerebelosa tipo 2, que seja capaz de tratar a doença ou de atrasar o seu curso. Como tal, o tratamento da ataxia espinocerebelosa tipo 2 tem sido limitado ao controlo dos sintomas. Algumas estratégias terapêuticas estão atualmente a ser desenvolvidas e diversos alvos terapêuticos continuam por explorar. Algumas das estratégias mais promissoras baseiam-se no silenciamento do gene ATXN2, mas até hoje ainda não foram testados métodos de silenciamento que atuem a nível genómico, em contraste com os métodos clássicos que atuam sobre as moléculas de ARNm. O sistema de edição génica CRISPR/Cas9 tem expandido as possibilidades de manipulação que pode ser exercida sobre o genoma, e sobre a expressão genética. Este sistema tem como base uma endonuclease, Cas9, e uma molécula de ARN guia (single guide RNA; sgRNA) que, quando combinadas, formam um complexo ribonucleoproteíco. O ARN guia direciona o complexo para uma região alvo do ADN, ligando-se a essa sequência por complementaridade de bases. A proteína Cas9 tem a capacidade de clivar ambas as cadeias da hélice dupla de ADN, introduzindo assim um corte na cadeia dupla. Este sistema pode ser explorado para produzir mutações em regiões particulares do genoma, decorrentes da reparação da região clivada. Alternativamente, a proteína Cas9 pode ser modificada e usada para direcionar inibidores da transcrição, como o domínio Krüppel-associated box (KRAB), para loci genéticos específicos. Este projeto teve como objetivo desenhar e desenvolver uma estratégia com potencial terapêutico para a ataxia espinocerebelosa tipo 2, sustentada no silenciamento do gene ATXN2 e recorrendo a ferramentas moleculares baseadas no sistema CRISPR/Cas9. Para alcançar este objetivo, foram testadas duas abordagens distintas. Primeiramente, procurou-se utilizar o sistema CRISPR/Cas9 convencional de modo a introduzir um codão de terminação prematuro no gene ATXN2 e assim incapacitar permanentemente a tradução de ataxina-2, num fase inicial da síntese proteica. Numa estratégia alternativa, recorreu-se a uma variante do sistema CRISPR/Cas, designado de CRISPR interference (CRISPRi), para reprimir a expressão do gene ATXN2 a um nível pré-transcricional. Esta última abordagem tomaria partido de um complexo proteico constituído por uma proteína Cas9 sem atividade catalítica (dCas9), fundida com um domínio KRAB. O bloqueio da expressão genética mediada por CRISPR/Cas9, na sequência de um corte da cadeia dupla de DNA, depende de um sistema endógeno de reparação do ADN - a união terminal não homóloga (non-homologous end-joining; NHEJ). Este processo introduz pequenas inserções ou deleções (indels) na cadeia de ADN, que levam consequentemente à formação de um codão de terminação prematuro a jusante do local reparado. De modo a introduzir um corte na cadeia dupla de DNA a montante do trato de CAGs do gene ATXN2, desenhou-se um sgRNA complementar a uma sequência presente entre o codão de iniciação da tradução e o início das repetições de CAG. A sequência de sgRNA foi clonada num plasmídeo de expressão que codificava Cas9 cataliticamente ativa, e este plasmídeo (Cas9/Indel) foi então transfetado em células HEK 293T, com o objectivo de se determinar o seu efeito na expressão do gene ATXN2, a nível de ARNm e da proteína ataxina-2, através de qPCR e Western blot, respetivamente. Os resultados de qPCR indicaram que os níveis de expressão de ARNm do gene ATXN2 em células HEK 293T transfetadas com Cas9/Indel não apresentavam uma diferença estatisticamente significativa comparativamente às condições controlo. Quanto aos resultados de Western blot, as células transfetadas com a ferramenta molecular em teste apresentaram uma tendência para uma redução dos níveis proteicos de ataxina-2. Contudo, tal como nos resultados de qPCR, esta diferença não se demonstrou estatisticamente significativa. Com o objetivo de silenciar a expressão de ATXN2 através de CRISPRi, desenharam-se várias sgRNAs capazes de direcionar a proteína de fusão dCas9-KRAB para o promotor do gene ATXN2. Esperava-se que a ligação da proteína dCas9-KRAB ao promotor do gene ATXN2 silenciaria a expressão do gene através do recrutamento, mediado pelo KRAB, de maquinaria modificadora de cromatina. Umas das sequências de sgRNAs foi clonada num plasmídeo codificando a fusão dCas9-KRAB, e células HEK 293T foram transfetadas com o plasmídeo assim gerado (dCas-KRAB/Prom2). O efeito desta estratégia na expressão do gene ATXN2 foi avaliado novamente a nível do mARN e da proteína ataxina-2, através de qPCR e Western blot. Os resultados de qPCR relativos aos níveis de ARNm do gene ATXN2 expressos por células transfetadas com dCas-KRAB/Prom2 não revelaram diferenças estatisticamente significativas, em comparação com os restantes grupos experimentais. A análise dos resultados de Western blot revelou uma tendência para a redução dos níveis proteicos de ataxin-2, comparando com as células não transfetadas, embora, uma vez mais, sem significância estatística. Este estudo demonstra a variedade de estratégias de silenciamento genético que se podem elaborar com base no sistema CRISPR/Cas9. Contudo, serão necessários estudos adicionais e a optimização de alguns dos procedimentos utlizados antes que se possa validar e estabelecer o potencial das duas estratégias desenvolvidas neste trabalho como estratégias putativas para o silenciamento do gene ATXN2 e o tratamento da ataxia espinocerebelosa tipo 2.engAtaxia espinocerebelosa tipo 2NeurodegeneraçãoEdição génicaSistema crispr/cas9Silenciamento génicomaster thesis202691039