Castelo-Branco, PedroTabori, UriApolónio, Joana2020-03-132020-03-132019-10-29http://hdl.handle.net/10400.1/13588Breast cancer (BC) is the most frequently diagnosed cancer and a leading cause of death among women worldwide. Early BC is potentially curable, nevertheless, the mortality rates still observed among BC patients, demonstrates the urgent need of novel and more effective diagnostic and therapeutic options. Limitless self-renewal is a hallmark of cancer governed by telomere maintenance. In around 95% of BC cases, this process is achieved by telomerase reactivation through upregulation of human Telomerase Reverse Transcriptase (hTERT). The hypermethylation of a specific region within hTERT promoter, termed TERT Hypermethylated Oncological Region (THOR) has been associated with increased hTERT expression in cancer. However, its biological role and clinical potential in BC has never been studied. Therefore, we aimed to investigate the role of THOR as a biomarker, explore the functional impact of THOR in hTERT upregulation, and also identify other potential DNA methylation-based markers in BC. Firstly, we demonstrated that THOR is significantly hypermethylated in malignant breast tissue when compared to benign tissue (40.23% vs. 12.81%), representing a potential candidate biomarker for future application in BC screening and early diagnosis. Importantly, as DNA methylation marks can be determined from blood samples, assessing THOR methylation status may constitute a non-invasive assay to help in BC management. Next, using a reporter assay, we revealed that THOR acts as a repressive regulatory element of hTERT, and that THOR hypermethylation might be relevant for hTERT upregulation in BC. To further investigate its biological impact on hTERT transcription, targeted THOR demethylation was performed using the CRISPR-dCas9 system. Although, THOR demethylation was achieved, hTERT mRNA levels were not significantly reduced. Surprisingly, cells previously demethylated on THOR region led to a remarkable reduction in tumor development in vivo. Therefore, additional studies are required to validate these observations and to unravel the causality between THOR hypermethylation and hTERT upregulation in BC. Finally, through a genome-wide methylation analysis, we identified three novel DNA methylation markers, located on the PRAC2, TDRD10 and TMEM132C genes that showed diagnostic and prognostic value in BC, as well as in other cancer types. This work evidences the importance of DNA methylation in breast tumorigenesis and, more importantly, their clinical value as promising diagnostic, prognostic and therapeutic targets in BC.O cancro da mama (CM) é o tumor maligno mais frequentemente diagnosticado, e uma das principais causas de morte entre as mulheres, em todo o mundo. Em 2018, cerca de 2,1 milhões de novos casos foram diagnosticados e 626.679 pessoas morreram por CM, em todo o mundo. No geral, o CM é o segundo tipo de cancro mais comum, a seguir ao cancro do pulmão, sendo considerada a quinta causa mais comum de morte devido a cancro. O CM consiste numa doença altamente heterogénea, que compreende diversos subtipos histológicos e moleculares, os quais diferem em termos de resposta à terapêutica e prognóstico da doença. A deteção precoce e os avanços no tratamento conduziram a uma melhoria significativa na sobrevivência e qualidade de vida dos pacientes, no entanto, o CM ainda está entre as principais causas de morte por cancro. Atualmente, quando detetado numa fase inicial da doença, é potencialmente curável mas as taxas de mortalidade ainda observadas entre os pacientes, demonstram a necessidade urgente de novas e mais eficazes opções de diagnóstico e terapêutica. A capacidade de autorrenovação ilimitada das células cancerígenas é uma característica fundamental do cancro, sendo alcançada pela manutenção dos telómeros. Em cerca de 95% dos casos de CM, este processo depende da reativação da enzima telomerase. A telomerase consiste num complexo ribonucleoproteico, constituído por uma subunidade catalítica, a transcriptase reversa da telomerase humana (hTERT) e uma subunidade de RNA, conhecida como componente de RNA da telomerase humana (hTERC). Tem sido proposto que a atividade da telomerase é determinada principalmente pela re-expressão da sua subunidade catalítica, a hTERT e, visto que, quer a atividade da telomerase, como a expressão da hTERT, estão aumentadas na maioria dos tumores malignos da mama, e ausentes na maioria dos tecidos somáticos normais, a telomerase/hTERT, bem como os seus mecanismos regulatórios, são considerados potenciais biomarcadores de cancro com implicações relevantes na prática clínica. Até à data, diversos mecanismos genéticos e epigenéticos demonstraram ser responsáveis pela regulação da hTERT, no entanto, a complexidade por trás da sua regulação no cancro não é ainda totalmente compreendida. Um dos mecanismos associados à expressão da hTERT no cancro é a hipermetilação de uma região específica do seu promotor, denominada como Região Oncológica Hipermetilada da hTERT (em inglês, THOR). Esta região demonstrou estar associada à progressão tumoral e à sobrevivência dos pacientes em diversos tipos de cancro, tais como, cancro da próstata, bexiga e pâncreas. No entanto, o seu papel biológico na ativação da transcrição da hTERT, bem como o seu potencial clínico no CM não foi ainda investigado. Deste modo, o principal objetivo do presente estudo, foi investigar o papel do THOR como biomarcador de doença em CM, bem como explorar o mecanismo pelo qual a hipermetilação do THOR contribui para a regulação positiva da hTERT. Adicionalmente, uma vez que vários estudos têm demonstrado que a metilação do DNA desempenha um papel relevante na patogénese do CM, pretendeu-se também identificar novos potenciais biomarcadores de diagnóstico e/ou prognóstico baseados em alterações nos padrões de metilação do DNA. Inicialmente, para avaliar o potencial do THOR como biomarcador clínico em CM, o seu nível de metilação foi analisado na coorte de carcinoma invasivo da mama disponível na plataforma de acesso público, The Cancer Genome Atlas (TCGA). Posteriormente, confirmaram-se os resultados utilizando duas coortes compostas por amostras de tecido de carcinoma invasivo de mama provenientes de mulheres diagnosticadas com CM no Centro Hospitalar Universitário do Algarve (CHUAlgarve, Faro, Portugal). Todas as coortes (TCGA e CHUAlgarve) revelaram que o THOR está significativamente hipermetilado no tecido mamário maligno quando comparado com o tecido benigno. A análise de metilação do THOR permitiu diferenciar cancro de tecido normal a partir do estádio mais inicial da doença (AUC> 0,9574, p <0,0001), evidenciando assim o seu potencial como biomarcador para deteção precoce do CM. Para além disso, quando comparado com os biomarcadores séricos, CEA e CA 15-3, o estado da metilação do THOR demonstrou ser mais representativo do estado atual do tumor do que os biomarcadores acima mencionados e, portanto, poderia ser usado no futuro como uma ferramenta valiosa para acompanhamento dos pacientes com CM. É importante ressaltar que, apesar de no presente estudo a hipermetilação do THOR ter sido determinada em amostras de tecido, esta pode constituir a base para o desenvolvimento de um ensaio não invasivo, e assim, melhorar a prática clínica. Os resultados obtidos revelam também que os pacientes com o THOR hipermetilado apresentam níveis mais elevados de expressão da hTERT, sugerindo assim que a metilação do THOR atua como um mecanismo de regulação positiva da ativação transcricional da hTERT. Neste sentido, de forma a investigar o papel funcional da hipermetilação do THOR na regulação génica da hTERT, foram realizados ensaios repórter de luciferase e a desmetilação direcionada do THOR com recurso ao sistema CRISPR-dCas9 em linhas celulares de CM. Os ensaios repórter revelaram que a região THOR atua como um elemento regulador repressivo da hTERT e que a sua hipermetilação pode ser relevante para a regulação positiva da hTERT no CM. Assim, para testar essa hipótese, utilizou-se o sistema CRISPR-dCas9 fundido com a enzima TET1 desmetilase, para avaliar se a desmetilação direcionada do THOR poderia reverter a regulação positiva de hTERT. Os resultados obtidos revelaram que a desmetilação específica da região THOR, foi conseguida, tendo-se obtido uma redução nos níveis de metilação de 15 a 70%, em determinadas CpGs. No entanto, apesar de se ter observado uma redução significativa na metilação do THOR, os níveis de mRNA da hTERT não foram significativamente reduzidos. Portanto, o presente estudo não nos permite estabelecer um efeito de causalidade entre a desmetilação do THOR e a inativação da transcrição da hTERT, sendo necessários estudos adicionais para desvendar esta hipótese. Porém, surpreendentemente, as células previamente desmetiladas na região THOR conduziram a uma notável redução no desenvolvimento de tumors in vivo, sendo essencial no futuro validar e determinar a razão biológica para estas observações. Por último, pretendeu-se destacar a importância das alterações epigenéticas na patogénese do CM e identificar novos biomarcadores de CM baseados na metilação do DNA. Para tal, realizou-se uma análise genómica dos padrões de metilação do DNA em CM e, avaliou-se o seu impacto na expressão génica. Estas análises foram efetuadas com recurso aos dados de metilação do DNA e de expressão génica, disponíveis nas bases de dados TCGA e METABRIC. De acordo com os resultados obtidos, foram identificados sete novos genes associados ao CM. Destes, os genes, PRAC2, TDRD10 e TMEM132C, apresentaram marcas de metilação do DNA com valor diagnóstico e prognóstico. Estes três novos biomarcadores baseados na metilação do DNA foram analisados em outras coortes de cancro disponíveis no TCGA e demonstraram ter também potencial diagnóstico e prognóstico noutros tipos de cancro. Em suma, o presente trabalho evidencia a importância dos padrões de metilação do DNA na patogénese do cancro da mama e destaca o seu potencial valor clínico. Particularmente, a hipermetilação do THOR é proposta como um alvo de diagnóstico e de terapêutica promissor para o CM.engCancro da mamaTelomerasehTERTTHORMetilação de DNABiomarcadoresdoctoral thesis101479999