Grenha, AnaRaimundo, Pedro2016-06-022016-06-0220142014http://hdl.handle.net/10400.1/8378Dissertação de Mestrado, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2014O interesse pela goma de alfarroba tem vindo a crescer ao longo dos últimos tempos. Inicialmente na região do Algarve utilizava-se a goma de alfarroba para alimentar animais de pecuária, contudo, por conter um polissacárido com propriedades importantes em variados setores económicos, passou a ser utilizada na indústria de transformação alimentar como espessante e na indústria farmacêutica como agente gelificante. Além das aplicações referidas anteriormente, a goma de alfarroba pode ser utilizada para muitas mais finalidades. Por se tratar de um polissacárido biodegradável e potencialmente não tóxico, revela-se interessante explorar as suas capacidades como material formador de matriz de sistemas de administração de fármacos e, nomeadamente, de proteínas, por vias mucosas. São vários os sistemas de administração, mas as nanopartículas têm chamado particularmente a atenção no âmbito da administração de proteínas. Para que uma administração por vias mucosas seja efetiva, os sistemas nanoparticulados devem ter um tamanho entre 50 e 500 nm (para maximizar a sua interação), e um potencial zeta positivo (para poderem interagir com o ácido siálico que tem carga negativa e se encontra na superfície das mucosas). Além disso, outras características são requeridas para que se possam utilizar estes sistemas para administração proteica, nomeadamente uma eficácia de encapsulação razoável e ausência de toxicidade. Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de nanopartículas de goma de alfarroba, para entrega de proteínas com fins sistémicos, através das vias mucosas. De modo a ir de encontro ao objetivo, o desenvolvimento do sistema nanoparticulado de goma de alfarroba proposto teve por base a utilização de um método de complexação polieletrolítica, segundo o qual as nanopartículas se formam por interação eletrostática entre grupos químicos dos polímeros que apresentam cargas opostas. Dada a neutralidade deste polissacárido, um trabalho anterior do grupo de investigação consistiu numa síntese química para produção de derivados carregados de goma de alfarroba. Foi assim produzido um derivado aminado e um derivado sulfatado, os quais exibem cargas opostas, permitindo a formação das nanopartículas por complexação polieletrolítica. As nanopartículas resultantes foram caraterizadas relativamente ao seu tamanho, índice de polidispersão, potencial zeta, rendimento de produção, eficácia de encapsulação, bem como quanto ao perfil de citotoxicidade no âmbito de administração por vias mucosas. Para preparar as nanopartículas foram utilizados três rácios de massa de goma de alfarroba aminada (A-LBG) e goma de alfarroba sulfatada (S-LBG), respetivamente 2/1, 1/1 e 1/2. Depois de obter as duas soluções respetivas, o S-LBG é adicionado ao A-LBG, sob agitação magnética moderada, em concentrações diferentes de modo a ter as três razões de massa. A formação das nanopartículas ocorre de forma imediata, mas as suspensões permanecem em agitação durante 10 minutos. Imediatamente após a mistura dos dois polímeros, é possível observar o efeito de Tyndall, que evidencia a formação de nanopartículas. As suspensões destas são centrifugadas a 16000xg, a 15 ºC durante 30 minutos, sobre uma camada de 10 μL de glicerol, a qual visa facilitar a ressuspensão das nanopartículas. Após a centrifugação, o sobrenadante é descartado e as nanopartículas são ressuspendidas em 100 μL de água para utilização nos ensaios subsequentes. A formulação A-LBG/S-LBG = 2/1 apresentou um diâmetro de aproximadamente 560 nm, um índice de polidispersão de 0,432 e um potencial zeta de +43,5 mV. A formulação A-LBG/S-LBG = 1/2 apresentou um diâmetro de aproximadamente 359 nm, um índice de polidispersão de 0,381 e um potencial zeta de -49,7 mV. A formulação A-LBG/S-LBG = 1/1 precipitou no momento em que o S-LBG foi adicionado ao A-LBG e, como tal, esta formulação foi abandonada. Atendendo a estes valores, em termos de diâmetro, a formulação 2/1 apresenta um diâmetro acima do que seria ideal e a formulação 1/2 apresenta um diâmetro entre os valores pretendidos. Relativamente à polidispersão, ambas as formulações apresentam valores abaixo do limite máximo aceite (0,5) no entanto estão acima do valor ideal (0,2). É no entanto importante assinalar que para nanopartículas produzidas com polímeros naturais é muito difícil obter índices de polidispersão abaixo de 0,2. Analisando os valores de potencial zeta, a formulação 2/1 apresenta um potencial positivo, que é mais coincidente com os objetivos da administração transmucosa, e a formulação 1/2 apresenta um potencial negativo. Os valores de potencial observados estão de acordo com a carga exibida pelo polímero predominante em cada formulação. O potencial negativo, apesar de não ser ideal para o objetivo de administração transmucosal, não é desfavorável, porque pode ser utilizado para outro tipo de terapias. Para o cálculo do rendimento de produção, a preparação das nanopartículas é feita como descrito anteriormente, com exceção do facto de não se utilizar glicerol, nem haver ressuspensão. Após a centrifugação o sobrenadante é descartado e o sedimento de nanopartículas é sujeito a congelação e posterior liofilização. A formulação 2/1 teve um rendimento de produção de aproximadamente 17% e a formulação 1/2 de 30%, os quais são considerados baixos. Para testar a capacidade das nanopartículas como transportadores de proteínas, a insulina foi selecionada como proteína modelo. Dado o seu ponto isoelétrico (pI), que é de 5.3, a proteína não dissolve em água. Para a sua solubilização usam-se o NaOH ou o HCl, ambos à concentração de 0,01 M, ficando a proteína com uma carga negativa ou positiva, respetivamente. Na abordagem inicial, tentou-se fazer a associação de uma quantidade de insulina equivalente a 30% do total da massa de polímeros utilizados na preparação das nanopartículas, mas não houve sucesso, já que se verificava precipitação. Após otimização do processo, assumiu-se a quantidade de insulina correspondente a 10% da massa do polímero que contribui com maior massa na preparação de cada formulação. Como a formulação A-LBG/S-LBG = 2/1 tinha mais quantidade de polímero positivo (conferindo um potencial zeta positivo), é maior o número de grupos carregados positivamente que estão disponíveis para interação com outras moléculas, em comparação com os grupos carregados negativamente. Assim, para esta formulação a insulina foi dissolvida em NaOH para assumir uma carga negativa e ter desta forma maiores probabilidades de interação e, consequentemente, de associação às nanopartículas. Após solubilização, a insulina foi adicionada à S-LBG, que tem igualmente carga negativa, evitando-se a interação eletrostática entre ambos os polímeros. Esta solução mista foi posteriormente adicionada à solução de A-LBG para formação das nanopartículas, havendo uma competição entre a insulina e a S-LBG pelos grupos carregados positivamente da A-LBG. Ao contrário, a formulação A-LBG/S-LBG = 1/2 tinha mais polímero de S-LBG, que tem carga negativa, o que proporciona em princípio maior capacidade de interação com grupos carregados positivamente. Neste caso, então, a estratégia consistiu em atribuir à insulina um predomínio de cargas positivas no momento da preparação das nanopartículas. Para isso, a proteína foi dissolvida em HCl e adicionada ao A-LBG, antes da adição desta mistura à S-LBG. A eficácia de encapsulação de insulina observada foi de 15% para ambas as formulações, um valor considerado reduzido. Com vista a aumentar a eficácia de encapsulação, foi feita uma otimização que teve por base a hipótese de alterar o pH do meio da insulina de forma a ficar próximo do seu ponto isoelétrico. A literatura disponibiliza pelo menos um trabalho que mostra que há uma maior adsorção das proteínas aos polímeros quando estas se encontram em meios com pH perto do seu ponto isoelétrico. No valor de pH equivalente ao ponto isoelétrico, a insulina ficará com um equilíbrio de cargas positivas e negativas e deixará livres as cargas dos polímeros, para interagirem entre si, maximizando a sua interação e a insulina ficará adsorvida aos polímeros na matriz das nanopartículas formadas. De forma a testar a hipótese anterior, para a formulação 2/1, a solução mãe de insulina foi preparada em NaOH, mas na preparação das diluições de A-LBG e S-LBG a partir das correspondentes soluções mãe, a água utilizada nas diluições foi substituída por tampão citrato (pH 5,0) por ter um pH próximo do ponto isoelétrico da insulina, fazendo com que esta exibisse um equilíbrio de cargas negativas e positivas após solubilização. Para a formulação 1/2 a insulina foi dissolvida em HCl e depois foi inicialmente realizado o mesmo procedimento com o tampão citrato, como para a formulação 2/1, mas ocorria precipitação. A otimização para a formulação 1/2 foi então realizada substituindo a água da solução S-LBG por uma solução de HCl a 0,1 M. As otimizações que foram operadas acolheram sucesso, tendo conduzido a um aumento das eficácias de encapsulação, na formulação 2/1 de 15% para 22% e na formulação 1/2 de 15% para 96%. As nanopartículas carregadas com insulina foram caraterizadas quanto às propriedades físico-químicas. Para a formulação 2/1 registou-se um diâmetro de 740 nm (PDI de 0,389) e um potencial zeta de +22,8 mV. Para a formulação 1/2 o diâmetro foi de 400 nm (PDI de 0,404) e o potencial zeta -33,6 mV. No entanto, na formulação 1/2 observaram-se alguns agregados de difícil ressuspensão, mesmo após alteração da quantidade de glicerol utilizada. Dado o objetivo de aplicação das nanopartículas desenvolvidas na administração por vias mucosas, considerou-se relevante avaliar a toxicidade das formulações. Realizou-se assim um ensaio de citotoxicidade em duas linhas celulares epiteliais, Caco-2 e A549. A primeira linha representa o epitélio intestinal, enquanto a segunda representa o epitélio pulmonar e, mais especificamente, alveolar. As concentrações testadas foram de 0,1 mg/mL, 0,5 mg/mL e 1 mg/mL para ambas as formulações. Os tempos de incubação das células com as nanopartículas foram de 3 horas e 24 horas para ambas as formulações, e linhas celulares, bem como para todas as concentrações. Em ambas as linhas celulares a viabilidade ficou acima de 70% para as duas formulações, indicando que as nanopartículas possuem baixa citotoxicidade. Em conclusão, os derivados de LBG sulfatado e aminado permitem a formulação de nanopartículas com capacidade para associar insulina. No entanto, a formulação 2/1 apresenta um tamanho inadequado para o objetivo de administração por vias mucosas, além de baixo rendimento de produção e eficácia de encapsulação. A formulação 1/2 apresenta um tamanho aceitável para o objetivo descrito, bem como uma eficácia de encapsulação muito significativa. No entanto, o rendimento da formulação é algo baixo e o seu potencial zeta negativo, possivelmente registando uma menor propensão para interação com a superfície epitelial em comparação com uma formulação de carga positiva. Este tipo de nanopartículas, pode ser utilizado em superfícies com carga positiva que requeiram nanopartículas com potencial zeta negativo, ou para encapsular moléculas de carga positiva, maximizando a sua interação.engAdministração de proteínasComplexação polieletrolíticaGoma de alfarrobaNanopartículasPolissacáridosmaster thesis202471870