Tavares, ÁlvaroDeckers, JeroenSilva, Francisca Borges Dias Monteiro da2024-02-202023-10-10http://hdl.handle.net/10400.1/20417Thyroid cancer affects millions of people worldwide, particularly women. While most thyroid cancer patients have a good long-term prognosis, advanced anaplastic thyroid cancer is one of the most aggressive human malignancies. For most patients suffering from anaplastic thyroid cancer, treatment options are severely limited as tumors are resistant to conventional treatments. Anaplastic thyroid cancers typically have a highly immunosuppressive, pro-tumorigenic phenotype, characterized by high levels of immune checkpoint expression and the accumulation of tumor-associated macrophages that can account for more than 50% of the tumor volume. These immune-mediated mechanisms that facilitate rapid tumor growth represent attractive new treatment opportunities, particularly combinations of immunotherapies targeting T-cells and macrophages. The concept of innate immune memory, also known as trained immunity, has recently gained significant attention in the study of the innate immune system. It has also been shown that the induction of trained immunity can help overcome immunosuppression and can be beneficial in the context of cancer. Given this fact, we proposed trained immunity as a therapy target to overcome the characteristic immunosuppressive environment of anaplastic thyroid cancer. The research was conducted to determine the best conditions for inducing trained immunity in bone marrow-derived macrophages. We focused on commonly used primary stimuli such as β-glucan, bacillus Calmette-Guérin (BCG) vaccine, and MDP and secondary bacterial stimuli. Furthermore, tumor culture medium was used as a secondary stimulus. Through measurements of cytokine production, we detected the induction of trained immunity in bone marrow-derived macrophages trained with BCG and we observed that factors released by tumor cells can have a comparable effect as bacterial stimuli. We also examined the effect of a tumor on the immune system, looking at the cytokine production of splenocytes and bone marrow-derived macrophages of tumor-bearing mice. At the same time, we analyzed immune cell populations of tumor-bearing mice using flow cytometry, focusing on myeloid, lymphoid, and progenitor cell populations. In summary, this study provides fundamental new knowledge on how to target the bone marrow and induce trained immunity as a new treatment paradigm for anaplastic thyroid cancer.O cancro da tiroide afeta milhões de pessoas em todo o mundo, especialmente mulheres. Embora a maioria dos doentes com cancro da tiroide tenha um prognóstico favorável a longo prazo, o cancro anaplásico avançado da tiroide é um dos cancros mais agressivo, tendo um prognóstico negativo. O tratamento convencionalmente utilizado é a cirurgia seguida do uso de iodo radioativo para eliminação do restante tumor. No entanto, para a maioria dos doentes com cancro anaplásico da tiroide, as opções de tratamento são severamente limitadas, uma vez que os tumores são resistentes ao iodo radioativo. Este tipo de cancro da tiroide desenvolve tumores rapidamente e de tamanhos exacerbados, levando, em muitos casos, a morte por asfixia. Os cancros anaplásicos da tiroide têm tipicamente um fenótipo altamente imunossupressor e pró-tumorigénico. Este é caracterizado por mutações - BRAF, TP53, RAS, TERT- responsáveis pela agressividade do tumor, e níveis elevados de recrutamento de macrófagos associados a tumores (TAMs), que podem representar mais de 50 % do volume tumoral. Estes mecanismos mediados imunologicamente que facilitam o crescimento rápido do tumor representam oportunidades atrativas para novos tratamentos, particularmente combinações de imunoterapias direcionadas a células T e macrófagos. O conceito de memória imunitária inata, também conhecida como imunidade treinada, tem ganho recentemente uma atenção significativa para o estudo do sistema imunitário inato. Este conceito é caracterizado pela capacidade do sistema imunitário inato de responder de forma mais eficaz a um patógeno ou estímulo após um encontro anterior com diferentes patógenos ou estímulos. Esta resposta imune é caracterizada por alterações epigenéticas persistentes nas células imunes, acompanhadas de uma maior produção de citocinas pró-inflamatórias. Ao contrário da imunidade adaptativa, que é mediada por linfócitos B e T e requer exposição prévia ao antígeno específico, a imunidade treinada é uma resposta imune inata, que envolve principalmente células como macrófagos e células natural killer (NK). Esta resposta imune pode ser regulada pelo uso de nanomateriais fabricados para inibir ou induzir imunidade treinada, dependendo do contexto da doença. Tem sido demonstrado que a indução da imunidade treinada pode ajudar a superar a imunossupressão característica do microambiente tumoral e pode ser benéfica no contexto do cancro. Com base nesse facto, propusemos a imunidade treinada como alvo terapêutico para superar o ambiente imunossupressor característico do cancro anaplásico da tiroide. O presente projeto teve como principais objetivos i) a otimização de condições indutoras de imunidade treinada em macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) de murganhos; ii) avaliar como estes BMDMs treinados reagiriam num contexto tumoral; iii) estabelecer o efeito de um tumor nas células imunes inatas e nos seus progenitores. Depois de concretizados estes primeiros objetivos, o projeto obtém linhas bases de conhecimento para avançar para o fabrico de nanomateriais direcionados à medula óssea. Estes terão como finalidade induzir imunidade treinada em macrófagos e será possível o seu teste em modelos animais de murganhos com cancro anaplásico da tiroide. Metodologicamente, foram feitos variados ensaios de imunidade treinada focados em estímulos primários comumente utilizados, como o β-glucano, a vacina bacilo Calmette-Guérin (BCG) e o dipeptídio muramil (MDP), e estímulos secundários bacterianos como o lipopolissacarídeo (LPS). Para avaliar a resposta das células treinadas a fatores tumorais, ensaios de imunidade treinada foram realizados usando como estímulo secundário meio de cultura tumoral. Este meio de cultura contém fatores libertados por células de melanoma B16F10 (linha celular de melanoma de murganhos C57BL/6J). Para verificar a indução de imunidade treinada nestes BMDMs depois dos diferentes estímulos, sobrenadantes foram recolhidos e realizamos medições da produção de citocinas pró-inflamatórias (TNF e IL-6), através de ELISA. Detetamos a indução da imunidade treinada em BMDMs treinados com BCG depois de reestimulados com LPS. Observamos também que fatores libertados pelas células tumorais podem ter um efeito comparável aos estímulos bacterianos. Portanto, BMDMs treinadas com BCG conseguem reagir num ambiente tumoral de uma forma pró-inflamatória, superando a imunossupressão do microambiente tumoral. Em experiências complementares foram avaliados outros estímulos usados comumente em monócitos, como Heat Killed Candida Albicans e Pam-3-cys. Foi-nos possível avaliar a incapacidade de usar Pam-3-cys devido à sua agressividade e capacidade de induzir alta inflamação neste tipo de macrófagos. Para além disso, testes usando imagem por ressonância magnética (MRI) foram realizados de maneira a avaliar a capacidade de visualizar e medir a tiroide e possíveis tumores nestes murganhos. Estes testes são fundamentais para verificar a viabilidade dos próximos passos do projeto. Com o intuito de perceber o efeito de um tumor no sistema imunitário inato, um modelo de melanoma em murganhos foi usado. Devido a limitações de tempo características do projeto não foi possível estabelecer um modelo de cancro anaplásico da tiroide, portanto um modelo de melanoma já estabelecido foi usado. Metodologicamente, células de melanoma foram inoculadas em murganhos por uma ou duas semanas antes do momento de eutanásia. Analisamos o estado de treino em esplenócitos e macrófagos derivados da medula óssea de murganhos portadores de tumor. Para isso estas células foram estimuladas com LPS e medimos a produção de citocinas pró-inflamatórias através de ELISA. Ao mesmo tempo, analisamos as populações de células imunitárias utilizando citometria de fluxo e focando-nos em populações de células mieloides, linfoides e progenitores. Em resumo, este estudo fornece novos conhecimentos fundamentais sobre como atingir a medula óssea e induzir a imunidade treinada como um novo paradigma de tratamento para o cancro anaplásico da tiroide. Estes resultados contribuem para um crescente corpo de conhecimento destinado a superar os desafios apresentados pelo microambiente imunossupressor desta forma agressiva de cancro. Para além disso, estabelecemos uma linha base de conhecimento acerca do efeito de um tumor no sistema imunitário inato, que será utilizado para avaliar a eficácia de possíveis nanomateriais usados para terapia deste cancro anaplásico da tiroide. Ao aproveitar o potencial da imunidade treinada e explorar abordagens inovadoras de imunoterapia, pretendemos melhorar os resultados do tratamento e, em última análise, aprimorar a qualidade de vida das pessoas que lutam contra o cancro anaplásico da tiroide.engCancro anaplásico da tiroideMacrófagos derivados da medula ósseaSistema imunitárioBCGImunidade treinadamaster thesis203532406