Belo, José AntónioFurtado, João Francisco Venturinha2015-09-092015-09-092015-09-092015-09-0920132013http://hdl.handle.net/10400.1/6753The vertebrate heart is a complex organ composed of several cell types, being developed through cardiogenic regions that have different expressing specific genes involved in heart specification. Understanding heart development on a molecular level is a requirement for unravel the causes of congenital heart diseases since specific cardiac lineages have been associated with cardiovascular malformations. During the course of a differential screen to identify transcripts specific for chick heart/hemangioblast precursor cells, we have identified Ccbe1 (Collagen and calcium-binding EGF-like domain 1). The current study intends to accomplish a detailed characterization of the expression pattern and functional analyses, by overexpression and knockdown approaches, of chick (c)Ccbe1. Whole-mount in situ hybridization analysis demonstrate that cCcbe1 is expressed in the early cardiac precursors of the heart forming regions at stage HH4 and at later stages is highly specific for the second heart field. Furthermore, functional analyses of cCcbe1 revealed an important role of cCcbe1 in early heart tube formation. In addition, the results presented in this thesis suggested that cCcbe1 is an important gene during heart development, is required for proper proliferation and migration of the heart precursors, and might be limited to multipotent and highly proliferative progenitors and downregulated upon cellular commitment into more specific cardiac phenotypes.A biologia do desenvolvimento é uma área que aborda os mecanismos envolvidos na formação progressiva de um animal a partir do ovo fertilizado, no qual abrange o crescimento, a diferenciação celular e a morfogénese que marcam as diversas fases do desenvolvimento dos seres vivos. Durante a embriogénese em vertebrados, o coração é o primeiro órgão a ser formado, tendo um papel vital na distribuição de nutrientes e oxigénio no embrião. Além disso, a cardiogénese é um processo muito sensível e consequentemente qualquer perturbação no desenvolvimento do coração leva a malformações cardíacas e, frequentemente, à morte embrionária. Realmente, a incidência de cardiopatias congénitas na população mundial é de 8 a 9 por 1000 nados vivos, sendo a segunda causa de morte no primeiro ano de vida, logo a seguir à prematuridade, segundo a Organização Mundial de Saúde. Devido à sua conservação evolucionária, o nosso conhecimento sobre a formação do coração foi praticamente adquirido através de estudos em modelos de organismos vertebrados, nomeadamente, anfíbios, ratinho e galinha. No presente estudo, o modelo escolhido foi o da galinha (Gallus gallus), isto porque trata-se de um modelo animal utilizado já há bastante tempo em estudos sobre a biologia do desenvolvimento. O embrião de galinha é de fácil acesso, grande e translúcido, o que o torna ideal para manipulações cirúrgicas. O seu estádio de desenvolvimento é facilmente previsível, podem ser cultivados “in vitro” durante 3 a 4 dias e são perfeitos para análise de linhagem e destino celular assim como para as técnicas de microinjeção. Além disso, o desenvolvimento embrionário do humano e da galinha partilham mecanismos morfológicos idênticos, e defeitos cardíacos encontrados no embrião de galinha são similares aos que se encontram nos humanos. Posto isto, o embrião de galinha como modelo embrionário oferece múltiplas vantagens em relação ao embrião de mamífero, uma vez que permite cultivar o embrião “ex ovo”, permitindo assim observar os movimentos celulares inerentes a formação do coração, algo que não e possível no embrião de mamífero. Grande parte do conhecimento acerca da região formadora do coração provém de estudos que utilizam o embrião de galinha como modelo. As células precursoras do coração são originárias do epiblasto, estas ingressam na linha primitiva e localizam-se na parte posterior da linha primitiva, (à exceção do nó de Hensen), migrando no sentido anterior-lateral e formando dois campos pré-cardíacos na placa mesodérmica anterior de cada lado da linha primitiva a estádio HH4-5 do desenvolvimento embrionário da galinha. Estas duas zonas cardíacas bilaterais, conhecidas como campo primário cardíaco, fundem-se a estádio HH9, aquando da diferenciação em cardiomiócitos, formando um único tubo cardíaco linear. Mais tarde no desenvolvimento cardíaco o campo secundário cardíaco é o responsável pela extensão do coração e consequente “looping” (HH11). Mesmo enquanto se forma, as regiões básicas do coração tornam-se aparentes, primeiro o “truncus” e ventrículos, depois o átrio e no final o “sinus-venosus”. A circulação fica estabelecida por volta do estádio HH16 e a divisão do coração em lado esquerdo e direito ocorre durante os dias 3-5 do desenvolvimento embrionário da galinha. No desenvolvimento cardíaco, a natureza do estabelecimento bioquímico e molecular é essencial para compreender a relação entre os aspetos genéticos e morfológicos da formação do coração. A necessidade de identificar genes que estão diferencialmente expressos entre populações de células dentro do embrião e do coração embrionário é um ponto crítico para a elucidação da complexidade que é a formação e o desenvolvimento do coração. Embora diversas linhas de evidência tenham determinado um certo número de genes como sendo cruciais para o desenvolvimento do coração, os indutores desses genes e os seus outros alvos permanecem desconhecidos. É por este motivo, que não é nada surpreendente descobrir que muito ainda permanece desconhecido em relação aos mecanismos que controlam a formação do coração. Para um melhor entendimento das moléculas e mecanismos envolvidos no desenvolvimento do coração foi efetuado no nosso laboratório um rastreio diferencial (Affymetrix GeneChip Chick system) para genes expressos nas células precursoras do coração/hemangioblasto. Este rastreio permitiu a identificação de novos genes com um aumento de expressão na região dos precursores cardiogénicos e entre eles estava o “Collagen and calcium-binding EGF-like domain 1” (cCcbe1). Esta proteína é altamente conservada entre espécies durante os processos de desenvolvimento, possuindo uma elevada homologia 79%, 70% e 80% com os seus homólogos em ratinho, peixe zebra e humano, respetivamente. Adicionalmente, cCcbe1 codifica para uma proteína de 396 aa e que contém um domínio, do inglês, Collagen and calcium binding EGF-like, normalmente presentes em grande número nas proteínas celulares e associadas às membranas. As moléculas pertencentes à família do EGF (do inglês Epidermal Growth Factor) possuem um papel importante no desenvolvimento e função do coração, e os seus domínios cálcio-EGF conservados, como aqueles detetados no Ccbe1, foram já associados à formação embrionária do coração. Neste contexto, procedeu-se ao estudo e caracterização do padrão de expressão do cCcbe1 utilizando-se técnicas de hibridação in situ e histologia. De modo a obter um maior detalhe na exatidão da caracterização do padrão de expressão do cCcbe1 realizaram-se hibridações in situ em conjunto com outros genes, nomeadamente, o Nkx2.5, um dos marcadores iniciais das células percursoras cardíacas e expresso no coração ao longo do desenvolvimento, nomeadamente em células na região cardíaca primária e secundária, e Islet-1, que expressa em células altamente proliferativas e indiferenciadas, nomeadamente em células na região cardíaca secundária. Os dados apresentados neste estudo revelam que cCcbe1 é expresso inicialmente (estádios HH4 a HH8) nos dois campos cardiogénicos na placa mesodérmica anterior de cada lado da linha primitiva. Durante estádios HH9 a HH13, o transcrito de cCcbe1 é detetado na região sino-atrial. Nestas regiões, os níveis do transcrito não são apenas encontrados na mesoderme paraxial, mas também na placa mesodérmica lateral esplâncnica e somática. Estes níveis elevados de expressão nestes domínios refletem um papel potencial de cCcbe1 no desenvolvimento dos sómitos e na formação do coração. Ao longo do desenvolvimento embrionário, desde o estádio HH14 a HH18, o cCcbe1 é expresso na região dorsal do coração (dorsal e lateralmente ao coração), nomeadamente, na zona onde a formação do conus arteriosus ocorre e perto dos arcos faríngeos, mais especificamente na região do campo cardíaco secundário. cCcbe1 também é detetado nos sómitos e na região da cabeça, especificamente, na área acima do olho conhecida como vena capitis (veia da cabeça). Ao realizar as duplas hibridações in situ verificou-se que cCcbe1 é co-expresso com os dois genes (Nkx2.5 e Islet1) na região do campo cardíaco primário e secundário a estadios inicias e posteriormente somente no campo cardíaco secundário durante o desenvolvimento do coração em embrião de galinha. Adicionalmente, em experiências de perda e ganho de função do cCcbe1 foi demonstrado que é necessário para a correta formação do coração. A injeção de oligonucleotido morpholino complementar ao gene cCcbe1, provocou malformações cardíacas nos embriões de galinha, no qual a fusão das duas regiões bilaterais formadoras do coração estava incompleta ou deficiente. O mesmo aconteceu quando se efetuou o ganho de função do cCcbe1, levando ao fenótipo de cardia bífida (as regiões formadoras do coração permaneceram na placa anterior da mesoderme sem que migrassem para a linha média do embrião de galinha e assim formassem um tubo cardíaco). Adicionalmente, verificou-se que o ganho e perda de função do cCcbe1 em embriões de galinha altera os níveis de proliferação cardíaca, e a alteração dos níveis de Hnk1 sugerem que a migração das células da crista neural cardíaca está afetada, levando a um desenvolvimento incorreto dos cardiomiócitos. De um modo geral, os resultados apresentados nesta tese sugerem que o cCcbe1 em galinha é expresso nas zonas formadoras do coração e é necessário durante o desenvolvimento inicial do coração.engCiências biomédicasGalinhaReproduçãoEmbriãoCoraçãoSistema cardíacodoctoral thesis101301510