Tavares, ÁlvaroGonçalves, Carolina Isabel Ramos2023-01-172023-01-172022-05-04http://hdl.handle.net/10400.1/18832O funcionamento correto da divisão celular é essencial para que o material genético seja transmitido, de forma que uma célula progenitora dê origem a duas células filhas geneticamente idênticas, assegurando a continuidade da vida. No caso deste processo ser comprometido, poderão surgir várias complicações como por exemplo o aparecimento de cancro. Os nossos estudos iniciais indicam que o gene humano Mob4/phocein é essencial para a execução da mitose, mais concretamente para o correto alinhamento dos cromossomas na placa metafásica durante a mitose, sugerindo que mutações neste gene poderá ser um dos fatores causadores da instabilidade genómica observada em células cancerosas. No entanto o mecanismo molecular de acção da Mob4/phocein está ainda por definir. Pretende-se com este projeto determinar esse mecanismo. Para tal, o projeto iniciar-se-á com a criação de linhas celulares nulas para o Mob4/phocein, por CRISPR, e pela sua caracterização. Nestas linhas determinar-se-á de seguida a acumulação e atividade de proteínas centrossomais e do cinétocoro e analisar-se-ão os defeitos mitóticos resultantes da supressão completa do gene. Em simultâneo será analisado o fenótipo de linhas mutantes em peixe-zebra, nulas para o Mob4 e já criados por Marco Campinho do CCMAR. As técnicas a utilizar neste projeto incluem i) microscopia de células fixas, tanto por imunofluorescência como por análise de células a expressar proteínas marcadas com GFP e RFP; ii) supressão por CRISPR da expressão de genes em linhas celulares humanas (linhas tumorais e primárias); iii) transformação de células em cultura; iv) purificação e manipulação de ácidos nucleicos; v) expressão e purificação de proteínas. Com o desenvolvimento deste projeto foi possível verificar e concluir que a nível das linhas celulares humanas, o CRISPr foi um sucesso quer a nível molecular quer a nível proteico; não parece haver influência na concentração total da proteína com o estímulo célula; a nível da co-localização de Mob4 com o Golgi em Hct-11, esta não parece existir; e infelizmente, não temos degradação indutível da proteína Mob4. Aquando do trabalho realizado em Zebrafish, foi possível o isolamento de 11 animais F1 carriers. Com isto, é necessário determinar porque é que nas CRAL1 a Mob4-AID-GFP não tem degradação induzida por auxina e cruzar os animais carriers entre si, de forma a originar o mutante homozigótico nulo, e observar o seu fenótipo.The correct functioning of cell division is essential for genetic material to be transmitted, so that a progenitor cell gives rise to two genetically identical daughter cells, ensuring the continuity of life. If this process is compromised, several complications may arise, such as the appearance of cancer. Our initial studies indicate that the human Mob4/phocein gene is essential for the execution of mitosis, specifically for the correct alignment of chromosomes in the metaphase plate during mitosis, suggesting that mutations in this gene may be one of the factors causing the observed genomic instability. in cancer cells. However, the molecular mechanism of action of Mob4/phocein is yet to be defined. It is intended with this project to determine this mechanism. To this end, the project will begin with the creation of null cell lines for Mob4/phocein, by CRISPR, and by their characterization. In these lines, the accumulation and activity of centrosomal and kinetochore proteins will then be determined and the mitotic defects resulting from complete gene deletion will be analyzed. Simultaneously, the phenotype of mutant lines in zebrafish, null for Mob4 and already created by Marco Campinho of CCMAR, will be analyzed. The techniques to be used in this project include i) fixed cell microscopy, both by immunofluorescence and by analysis of cells expressing proteins tagged with GFP and RFP; ii) CRISPR suppression of gene expression in human cell lines (tumor and primary lines); iii) transformation of cells in culture; iv) purification and manipulation of nucleic acids; v) expression and purification of proteins. With the development of this project, it was possible to verify and conclude that at the level of human cell lines, CRISPr was a success both at the molecular and protein levels; there seems to be no influence on the total protein concentration with the cell stimulus; at the level of the co-location of Mob4 with the Golgi in Hct-11, this does not seem to exist; and unfortunately, we don't have inducible degradation of the Mob4 protein. During the work carried out on Zebrafish, it was possible to isolate 11 F1 carrier animals. With this, it is necessary to determine why Mob4-AID-GFP in CRAL1 does not have auxin-induced degradation and cross the carrier animals with each other, in order to generate the homozygous null mutant, and observe its phenotype.porMob4/phoceinProteínaMitosemaster thesis203088859