Conchinha, Nadine Vasconcelos2017-09-292017-09-292016-09-282016http://hdl.handle.net/10400.1/10062Dissertação de mestrado, Ciências Biomédicas, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade do Algarve, 2016Endothelial cells (ECs) are located in the innermost layer of blood vessels and are in direct contact with the blood stream. ECs in established, healthy blood vessels are quiescent and most of them can stay in their quiescent state for many years but when stimulated under physiological or pathological conditions, they become proliferative and allow vessel growth (process called angiogenesis). Due to their key localization, ECs are involved in many different functions like fluid filtration, blood vessel tone, homeostasis and oxygen and nutrients supply. Thus, it is not surprising that when ECs become dysfunctional, they contribute to a large range of diseases like hypertension, atherosclerosis, thrombosis, leakage, stroke, tissue ischemia, etc. The host lab already characterized some metabolic features of proliferating ECs that are affecting sprouting and migration of ECs cells. These studies showed that EC metabolism could be a promising target for anti-angiogenesis therapies. However, in spite of recent advances, the metabolism of the quiescent endothelium remains incompletely understood. In this project we sought to study the metabolic changes facilitating the switch from proliferating to quiescent ECs. Our first results showed that during this switch glucose oxidation and glycolytic flux are reduced, whereas fatty acid ß-oxidation (FAO) is increased. As quiescent ECs are exposed to an oxygen-rich microenvironment, we hypothesize that the FAO derived acetyl-CoA fuels the TCA cycle to produce NADPH to preserve the redox homeostasis of the cell. Mechanistically, activation of Notch signaling pathway regulate the induction of the metabolic changes in quiescent ECs.As células endoteliais estão localizadas na camada mais interna dos vasos sanguíneos e por isso contactam diretamente com o sangue, captando e fornecendo posteriormente oxigénio e nutrientes para todos os tecidos. A maioria das células endoteliais permanece em estado quiescente por muitos anos mas quando estimuladas sob condições fisiológicas como por exemplo durante o ciclo menstrual ou patológicas como no caso de progressão tumoral tornam-se proliferativas e permitem o crescimento dos vasos (processo chamado de angiogénese). Devido a sua localização chave, as células endoteliais estão envolvidas em muitas funções vasculares, como filtração de fluidos, a dilatação dos vasos sanguíneos, homeostasia e fornecimento de nutrientes e oxigénio a outros tecidos. Assim, não é surpreendente que quando se tornam disfuncionais podem contribuir para uma grande variedade de doenças, como a hipertensão, a aterosclerose, trombose, acidente vascular cerebral, isquemia de tecido, etc. Em trabalhos anteriores, o laboratório caracterizou as células endoteliais em estado proliferativo e como o metabolismo de influenciar o crescimento e a migração destas células. Estes estudos mostraram que alvejando o metabolismo endotelial é possível inibir a angiogénese patológica. Assim, o metabolismo possui um elevado potencial de utilização na clínica para o tratamento da angiogénese patológica. No entanto, sobre as células endoteliais (ECs) quiescentes, que constituem 99,9% do total de células endoteliais no corpo humano e desempenham um papel muito importante para a manutenção do endotélio saudável, ainda muito pouco estudado sobre elas. Para este trabalho, o objetivo foi compreender as adaptações metabólicas das células endoteliais quiescentes e o mecanismo que suporta essas adaptações. Como ponto de partida, estudou-se a quiescência em células endoteliais inibidas por contacto. Para isso, células endoteliais de veia de cordão umbilical foram cultivadas e cresceram durante 7 dias até atingirem a máxima confluência e pararem de crescer. Durante os 7 dias de indução de quiescência, os níveis proliferativos e também as principais vias metabólicas usadas pelas células endoteliais proliferativas, glicólise e oxidação de ácidos gordos (FAO), foram analisados através de ensaios com tracers radioativos. A proliferação celular e os níveis de glicólise gradualmente desceram ao longo dos dias enquanto os níveis de oxidação de ácidos gordos subiram. Em adição a estas análises, testou-se os níveis proteicos de PFKFB3 e CPT1a (enzimas limitantes para a glicólise e para a oxidação de ácidos gordos) que mostraram a tendência dos ensaios metabólicos realizados primariamente. A via de Notch é conhecida por ser altamente conservada e regular o ciclo celular durante o desenvolvimento embrionário. Em células endoteliais, a via de Notch foi relacionada com a paragem do ciclo celular e por isso durante os 7 dias para indução de quiescência, os níveis proteicos de domínio intracelular de Notch foram testados e mostraram um aumento comparando com o primeiro dia. Com o objetivo de avaliar a importância de Notch para as adaptações metabólicas nas células endoteliais quiescentes, testou-se o efeito do seu bloqueio nos níveis de glicólises e oxidação de ácidos gordos que mostraram que as células endoteliais quiescentes eram incapazes de reduzir os níveis de glicólise e induzir os níveis de oxidação de ácidos gordos. Como seguimento destes resultados, investigou-se a capacidade de Notch em induzir quiescência endotelial e para isso HUVECs foram cultivadas em gelatina suplementada com o ligante de Notch - DLL4 - e com BSA para as células controlo. A fim de avaliar se ECs estimuladas com DLL4 se comportavam de forma semelhante às ECs contacto-inibidas, os níveis proliferativos, glicolíticos e FAO foram analisados e juntamente com os níveis de proteína CPT1a. Os resultados mostram diminuição dos níveis de glicólise e aumento dos níveis de FAO em ECs estimuladas com DLL4, tal como foi observado em ECs contacto-inibidas. Portanto, foi possível confirmar que a estimulação da via de Notch imitava as características das ECs contacto-inibidas. Tendo em conta os elevados níveis de FAO que se observaram, no passo seguinte investigou-se o papel da FAO em ECs de repouso. A importância da FAO foi reportado anteriormente em vários tipos de células. FAO serve possui três funções principais: (1) a produção de energia, como em cardiomiócitos, (2) limpeza de ROS, descrita em células de cancro e (3) no caso de fibroblastos e ECs proliferativas para produzir nucleótidos. No âmbito desta tese decidimos investigar o papel da FAO na produção de ATP e ROS limpeza apenas porque as ECs reduzem significativamente a sua taxa proliferativa quando se tornarem quiescentes e por isso se especule que o aumento da FAO não serve para a produção de nucleótidos. Para avaliar o papel da FAO em ECs quiescentes, CPT1a foi silenciado por knock-down, o que levou a uma redução significativa no fluxo FAO. A fim de analisar as alterações na produção de ATP na ausência de CPT1a, medimos níveis de ATP entre proliferação e células quiescentes e também em células com CPT1a silenciado. Os níveis de ATP não se alteraram entre ECs proliferativas ou quiescentes, nem quando comparando células CPT1a silenciado versus células controlo. A fim de melhor compreender se FAO estava envolvido na produção de ATP, foram analisados os níveis de proteína de AMPK. AMPK é um sensor de tensão metabólica, que deteta a necessidade de ATP. No nosso caso, o bloqueio de FAO não induziu um aumento deste sensor mostrando mais uma que FAO não é relevante para a produção de ATP. Como mencionado acima, para além da produção de ATP, FAO também gera os reguladores-chave para a homeostasia oxidativa durante o ciclo do TCA, como a NADPH. Antes da avaliação da participação da FAO na limpeza de ROS, os níveis de ROS foram analisados nas células quiescentes por contacto-inibição e mostraram uma tendência inversamente proporcional em relação a tendência observada para oxidação de ácidos, mostrando assim um decréscimo dos níveis de ROS ao longo da indução da quiescência. A fim de avaliar nas células endoteliais a relevância de FAO para a redução dos níveis de intracelulares de ROS, CPT1a foi irreversivelmente inibido através do tratamento com Etomoxir bloqueando quase absolutamente a realização de FAO pelas nossas células. O bloqueio de FAO nas células quiescentes por contacto inibição mostrou a perda da sua capacidade de limpeza de ROS. Também o bloqueio de Notch conduziu a um aumento dos níveis de ROS nas células endoteliais quiescentes, realçando a sua importância como mediador mecanístico das adaptações observadas nas células endoteliais quiescentes. Por fim, decidimos testar a capacidade de limpeza de ROS e a importância de FAO para o mesmo e por isso testámos nas ECs estimuladas com DLL4 em condições normais e oxidativas (tratadas com H2O2) foram analisados e mostraram que as células quiescentes possuem níveis mais baixos de ROS em condições basais e quando sob condições de stress oxidativo provaram ser capaz de limpar com mais eficiência os ROS em comparação com ECs proliferativas. De facto, ECs podem estar quiescentes durante longos períodos de tempo e durante os quais precisam se proteger eficazmente contra ROS. Quando analisado o efeito do silenciamento de CPT1a na limpeza de ROS, verificou-se que o bloqueio de FAO conduzia a um aumento nos níveis de ROS tanto em células proliferativas como quiescentes, embora a diferença entre células quiescentes controlo e com CPT1a silenciado tenha sido mais pronunciada. Assim foi concluído com o trabalho desenvolvido, que as ECs quiescentes adaptam o seu metabolismo dependendo de FAO para lutar contra o stress oxidativo e que Notch é um importante mediador da adaptação metabólica.engCélulas endoteliaisQuiescênciaOxidação de ácidos gordos (FAO)Notchmaster thesis201705850