Barata, João PedroMaia, Ana TeresaSoares, Tiago André Dias2018-12-192018-12-192018-07-032017http://hdl.handle.net/10400.1/12254Acute lymphoblastic leukaemia (ALL), the most common childhood malignancy, is characterized by the accumulation of immature lymphoid cells, of either B or T cell origin, in the bone marrow and lymphoid tissues. B cell ALL (B-ALL) is the most common acute leukaemia in children, accounting for 85% of ALL cases, whereas patients with ALL of T cell phenotype (T-ALL) present with high risk. Although ALL treatment has improved in recent years, secondary effects can be severe and around 15-25% of the patients relapse. Hence, better treatments are needed. Interleukin 7 (IL-7) and its receptor (IL-7R; constituted by the IL-7Rα and γc chains) are critical for normal B and T cell development, and IL-7/IL-7R signalling is involved in cell survival, proliferation and differentiation. In Prof. João Barata´s Lab, gain-of-function mutations, present in roughly 10% of T-ALL patients, were previously identified in the exon 6 of IL7R gene, which encodes IL-7Rα. These mutations lead to constitutive activation of IL-7R mediated signalling, without the requirement for the ligand. The aim of this thesis was to study the impact of IL7R gain-of-function mutation in in vivo leukemogenesis. For this purpose, we developed a mouse with conditional expression of the mutated Il7r gene using the CRE/LoxP system and crossed it with CRE lines of interest: CD2CRE; CD4CRE; VavCRE and pLCKCRE. Progeny of these crossings was analysed by performing flow cytometry analysis on blood samples and monitoring leukaemia development. Overall, results show that IL-7R mutational activation has a clear effect in the B cell compartment, while only more subtle changes could be scored in the T cell lineage. The B cell-related alterations affect immature populations in all the animals and an important fraction of these develop B cell leukaemia, which we characterized as B cell precursor ALL. In order to evaluate oncogenic dose effects, we generated animals with homozygous Il7r mutation. Progeny showed a more striking phenotype affecting the B cell compartment when compared to heterozygous mice, as shown by flow cytometry. Western Blot analysis confirmed upregulated signalling in homozygous leukemic cells as compared to heterozygous leukemias and controls.A leucemia linfoblástica aguda (LLA) é o cancro mais comum em crianças e é caracterizada pela acumulação de células linfóides, tanto de origem B como T na medula óssea e tecidos linfóides. Leucemia linfoblástica aguda de células B (LLA-B) é a leucemia mais comum em crianças, contabilizando 85% dos casos de LLA, enquanto pacientes com LLA T apresentam risco elevado. Embora os tratamentos para LLA tenham melhorado nos últimos anos, os efeitos secundários destas terapias podem ser severos e cerca de 15-25% dos pacientes sofrem recaídas. Por isso, melhores terapias são necessárias. A interleucina 7 (IL-7) e o seu receptor (IL-7R; constituído pelas sub-unidades IL7-Rα e γc) é crucial no desenvolvimento de células T e de células B, estando a sinalização através do IL-7/IL-7R envolvida em sobrevivência, proliferação e diferenciação. No laboratório do Prof. João Barata foram descrita uma mutação de ganho de função no exão 6 do gene do IL7R, que codifica para o IL-7Rα, presentes em 10% de pacientes com LLA. Esta mutação leva a uma activação constitutiva do receptor IL-7, sem necessidade de ligando. O objectivo desta tese foi estudar o impacto de mutações de ganho de função no IL7R in vivo na génese de leucemia. Para este efeito, foi desenvolvido um animal com expressão condicional do receptor do IL-7 mutado usando o sistema CRE/LoxP e este foi cruzado com animais CRE de interesse: CD2CRE; CD4CRE; VavCRE and pLCKCRE. A descendência destes cruzamentos foi analisada por citometria de fluxo em amostras de sangue. Os resultados demonstram que a activação resultante da mutação no receptor IL-7 tem um impacto no compartimento B, enquanto apenas alterações subtis foram observadas na linhagem T. Estas alterações afectam a população B imatura em todos os animais e uma fracção importante destes animais desenvolveram LLA de células percursoras B. Para avaliar o efeito de dose oncogénica, foram gerados animais homozigóticos para o IL-7R mutado. Usando a análise por citometria de fluxo, estes animais apresentaram um fenótipo mais acentuado no compartimento B que os animais heterozigóticos. Análise por Western Blot confirmou um aumento geral de sinalização nos animais homozigóticos quando comparados com animais heterozigóticos e respectivos controlos.engLeucemia linfoblástica agudaReceptor IL-7Citometria de fluxoDesenvolvimento células BMutação “gain-of-function”master thesis202028739