Goot, Gisou van derMartinho, Rui GonçaloMozes, André Ribeiro da Graça Lima2020-03-032020-03-032019-01-18http://hdl.handle.net/10400.1/13556In the last two decades the Extracellular Vesicles (EVs) field has attracted a lot of attention from the scientific community, especially after the discovery that EVs can shuttle functional proteins and nucleic acids between cells. Some recent studies have shown an association between tumorigenesis and increased exosomes production. Exosomes and their influence has also been reported in the establishment of new metastatic niches. Besides that, the EV field remains confusing due to numerous and ambiguous definitions, specially caused by the huge heterogeneity of the vesicles, both in composition and function. Extracellular vesicles are divided into microvesicles which are originated from the plasma membrane and exosomes which have an endosomal origin. For now, it is technically challenging to obtain a pure exosome fraction, free from non-vesicular components, due to the fact the extracellular milieu is quite complex and can contain microvesicles or apoptotic bodies similar in size and structure to exosomes. The two most used methods, ultracentrifugation and commercial kits, don’t show a good efficiency when distinguishing the exosomes fraction specifically from the microvesicles fraction. Due to this sub-optimal efficiency demonstrated by these two methods, we have decided to use Flow Cytometry to see if we can achieve better exosome purification. We will use Fluorescence-activated cell sorting (FACS) to purify endogenous exosomes. This would be quite challenging especially due to the exosomes size and heterogeneity but on the other hand, if we have success with our approach, it would be possible to do downstream analysis in order to know their protein composition, functions and elaborate some more studies to try to find some “exosome-specific” marker. This would have a huge impact in the pharmaceutical industry, both for diagnosis and therapy.Durante as últimas duas décadas, a investigação desenvolvida sobre Vesículas extracelulares (VE), atraíu o bastante interesse por parte da comunidade científica, especialmente após ter sido descoberto que as VE podem transportar proteínas funcinais e ácidos nucleicos entre diferentes células. Estudos mais recentes mostraram uma relação entre tumorogenese e um aumento na produção de exosomas. Estes foram também associados ao estabelecimento de novas metástases. Apesar de todas estas descobertas, o domínio das VE continua significativamente confuso, nomeadamente devido às numerosas e ambíguas definições utilizadas, especialmente devido ao facto da imensa heterogeneidade entre as diversas VE, tanto a nível de composição como de função. Vesículas extracellulares estão divididas em microvesículas, que são originárias da membrana plasmática, e exosomas que têm uma oigem endossomal. No presente, é tecnicamente bastante complicado de obter uma fracção de pura exosomas que não apresente componentes não vesiculares, principalmente pelo facto do meio extracellular ser bastante complexo e poder conter microvesícula e corpos apoptóticos semelhantes em termos de tamanho e estrutura. Os dois métodos mais usados, a ultracentrifugação e kits comerciais, não apresentam uma boa eficiência na distinção de exosomas, especialmente das microvesículas. Devido a esta eficiência sub-óptima demonstrada por estes dois métodos, decídimos usar a separação celular por citometria de fluxo (FACS) para proceder ao isolamento de exosomas endógenos. Este objectivo será bastante desafiador especialmente pelo tamanho e heterogeneidade dos exosomas mas, por outro lado, se formos suficientemente bem sucedidos na nossa abordagem, será possível realizar análises posteriores, de modo a conhecer a sua composição proteica, funções e partir para novos estudos de modo a tentar identificar um marcador molecular específico para exosomas. Isto teria um impacto significativo na indústria farmacêutica, tanto a nível de diagnóstico como terapêutico.engVesículas extracelularesExosomasFACSIsolamentomaster thesis202245020