Guerreiro, Pedro Miguel Guerreiro da CostaModesto , Teresa Isabel MendonçaValle, Michela della2025-04-142025-04-142024-09-12http://hdl.handle.net/10400.1/27021Halobatrachus didactylus, commonly known as the Lusitanian toadfish, is a benthic sedentary species inhabiting coastal waters, which mucus was recently found to have toxic activity over bacteria and other fish, likely playing a role as an immune and defense mechanism. This study aimed to investigate which conditions, intrinsic or external, may determine the toxicity of the mucus over other fish species, including amount, stress, sex and salinity, while understanding the potential role of the skin and axillary glands in toxin production. Through a series of in vivo and in vitro experiments, the toxicity of the mucus was evaluated using Sparus aurata and Gambusia holbrooki as test subjects. The experiments showed that the lethal effect of the toxin is dose dependent, either when collected mucus was added to water or when toadfish holding water was used. The results also revealed that male mucus have higher toxicity than female mucus, reflected in higher lethality of test subjects exposed to the same conditions. Haemolytic activity experiments showed differences in toxicity between sexes, with male mucus causing higher hemolytic activity. The toxin is likely hydrophilic as it maintains activity in the toadfish holding water, but environmental salinity was found to influence the toxin’s effectiveness: mucus added to seawater was effective while freshwater conditions nullified the mucus's lethality, suggesting that the toxin may require specific environmental conditions or physiological pathways to be active to evoke an effect. While the skin mucus clearly demonstrated toxic properties, no significant toxic effect was detected from the contents of the axillary glands, challenging the hypothesis of their involvement in toxin production. The histological analysis revealed a higher density of skin mucus cells in males compared to females, raising questions about sex-based physiological differences in mucus production and toxicity. This research provides new insights into the toxicological properties of H. didactylus and suggests that its mucus plays a dual role in predation defense and microbial protection. However, further biochemical analyses are required to fully understand the molecular composition of the toxin, actual sites and regulatory mechanisms of secretion, and its ecological significance.Este trabalho centra-se sobre as propriedades toxicológicas do muco produzido por Halobatrachus didactylus (n.v. xarroco ou peixe-sapo lusitano), uma espécie bentónica e eurihalina pertencente à família Batrachoididae. Os membros desta família estão distribuídos por praticamente todas zonas costeiras temperadas e tropicais do planeta, e muitas das espécies que a compõem produzem substâncias com propriedades tóxicas. O xarroco, que habita as águas costeiras da região nordeste do Oceano Atlântico e algumas zonas do Mar Mediterrâneo, é uma espécie bentónica e eurihalina que vive sob pedras e em fendas, alimentando-se de pequenos peixes, crustáceos, moluscos e poliquetas. Embora consiga deslocar-se pelos estuários ou lagoas, esta espécie é geralmente sedentária, com taxas metabólicas baixas, reproduzindo-se próximo ao fundo do mar, onde os machos territoriais atraem as fêmeas para seus ninhos com sons produzidos pela contração dos músculos sonoros na bexiga natatória; um repertório variado de sons é também utilizado com funções defensivas para afastar outros machos. A espécie apresenta táticas reprodutivas alternativas, com dois tipos de machos: tipo I e tipo II. Os machos do tipo II, geralmente menores, apresentam comportamentos parasitas dos machos tipo I, pois não cortejam as fêmeas nem constroem ninhos, aproveitando-se da sua semelhança com as fêmeas para se infiltrar no ninho do macho tipo I e tentar fertilizar os ovos que ficam aderidos às paredes e tetos dos ninhos. Apesar dos fortes espinhos na barbatana dorsal, o xarroco, ao contrário de muitas espécies deste grupo, não apresenta espinhos ocos ou outras formas evidentes de inocular substâncias tóxicas. No entanto, estudos recentes mostraram que o muco desta especie é tóxico para várias espécies de peixes, induzindo alterações drásticas no seu comportamento e, inclusivamente a morte. Até ao momento foram avaliadas as propriedades antimicrobianas do muco e foi demonstrado o seu efeito em vários parâmetros hematológicos e na função dos nervos olfativos de outras espécies, mas o papel ecológico da toxicidade do muco de H. didactylus é ainda pouco claro. O objetivo geral desta tese foi investigar as recém-descobertas propriedades tóxicas do muco de H. didactylus, com foco nas condições que podem modular a sua secreção e potência, bem como nos locais efetivos de produção. O primeiro objetivo deste estudo foi determinar se o efeito tóxico previamente observado era atribuível ao muco produzido pela pele ou se poderia provir de outros tecidos ou glândulas, já que estudos anteriores haviam apenas utilizado a água na qual foram imersos xarrocos. Para isso, testámos o muco coletado diretamente da pele e as secreções da glândula axilar, comparando os efeitos com aqueles provocados pela água onde estiveram imersos os peixes, conforme os protocolos anteriores, além de analisar a estrutura da Este trabalho centra-se sobre as propriedades toxicológicas do muco produzido por Halobatrachus didactylus (n.v. xarroco ou peixe-sapo lusitano), uma espécie bentónica e eurihalina pertencente à família Batrachoididae. Os membros desta família estão distribuídos por praticamente todas zonas costeiras temperadas e tropicais do planeta, e muitas das espécies que a compõem produzem substâncias com propriedades tóxicas. O xarroco, que habita as águas costeiras da região nordeste do Oceano Atlântico e algumas zonas do Mar Mediterrâneo, é uma espécie bentónica e eurihalina que vive sob pedras e em fendas, alimentando-se de pequenos peixes, crustáceos, moluscos e poliquetas. Embora consiga deslocar-se pelos estuários ou lagoas, esta espécie é geralmente sedentária, com taxas metabólicas baixas, reproduzindo-se próximo ao fundo do mar, onde os machos territoriais atraem as fêmeas para seus ninhos com sons produzidos pela contração dos músculos sonoros na bexiga natatória; um repertório variado de sons é também utilizado com funções defensivas para afastar outros machos. A espécie apresenta táticas reprodutivas alternativas, com dois tipos de machos: tipo I e tipo II. Os machos do tipo II, geralmente menores, apresentam comportamentos parasitas dos machos tipo I, pois não cortejam as fêmeas nem constroem ninhos, aproveitando-se da sua semelhança com as fêmeas para se infiltrar no ninho do macho tipo I e tentar fertilizar os ovos que ficam aderidos às paredes e tetos dos ninhos. Apesar dos fortes espinhos na barbatana dorsal, o xarroco, ao contrário de muitas espécies deste grupo, não apresenta espinhos ocos ou outras formas evidentes de inocular substâncias tóxicas. No entanto, estudos recentes mostraram que o muco desta especie é tóxico para várias espécies de peixes, induzindo alterações drásticas no seu comportamento e, inclusivamente a morte. Até ao momento foram avaliadas as propriedades antimicrobianas do muco e foi demonstrado o seu efeito em vários parâmetros hematológicos e na função dos nervos olfativos de outras espécies, mas o papel ecológico da toxicidade do muco de H. didactylus é ainda pouco claro. O objetivo geral desta tese foi investigar as recém-descobertas propriedades tóxicas do muco de H. didactylus, com foco nas condições que podem modular a sua secreção e potência, bem como nos locais efetivos de produção. O primeiro objetivo deste estudo foi determinar se o efeito tóxico previamente observado era atribuível ao muco produzido pela pele ou se poderia provir de outros tecidos ou glândulas, já que estudos anteriores haviam apenas utilizado a água na qual foram imersos xarrocos. Para isso, testámos o muco coletado diretamente da pele e as secreções da glândula axilar, comparando os efeitos com aqueles provocados pela água onde estiveram imersos os peixes, conforme os protocolos anteriores, além de analisar a estrutura da em comparação com o das fêmeas, especialmente visíveis na diluição 1:100. A concentração de proteínas nas amostras, quer as utilizadas na atividade hemolítica, quer as utilizadas nas experiências in vivo, mostra estar relacionada com quantidade de muco; as amostras de muco obtidas de machos mostraram consistentemente valores mais elevados de proteína para a mesma quantidade de muco. Este resultado parece indicar que a toxina poderá ter uma natureza proteica, corroborado parcialmente pela sua aparente facilidade em ser solúvel em água. Porém, não sabendo a composição exacta da toxina, não podemos assumir categoricamente que maior quantidade de proteínas equivale a maior quantidade de toxina. A análise histológica foi efetuada em três amostras de pele e na glândula axilar. Foram utilizadas diferentes colorações para realçar eventuais diferenças estruturais e de composição química. A partir da reação com a coloração azul de Alcian, foi possível observar que as células do muco contêm substâncias ácidas e que existe uma maior densidade das mesmas na pele dos machos em comparação com as fêmeas. Relativamente às glândulas axilares não há diferença na quantidade de células mucosas mas pode haver diferenças relativamente às células saciformes. Seria necessária uma abordagem histológica mais detalhada para validar possíveis diferenças entre machos e fêmeas e entre animais stressados e não stressados. Em conclusão, este trabalho provou haver uma relação entre a potência da toxina e a dose, diferenças de potência entre machos e fêmeas e a importância das condições ambientais para a sua ação. Este conjunto de informações são úteis para avaliar o potencial significado ecológico da toxina e fornece pistas relativamente à sua natureza e local de produção. No entanto, será necessário efetuar outras abordagens para identificar a composição química da toxina e compreender a sua proveniência, condições de secreção, e os mecanismos de ação noutros peixes.engHalobatrachus didactylusBiotoxinSkinModulation of toxic activitySparus aurataGambusia holbrookiDefensemaster thesis203802888