Méndez-Lucas, AndrésNovellasdemunt, LauraCoelho, Ana Luísa de SousaYassuda, Victor2026-05-262026-05-262025-11-13http://hdl.handle.net/10400.1/29042Cancer is a second leading cause of disease-related death worldwide, with one of its defining hallmarks being the tumor metabolism reprograming to sustain growth and survival. While glucose and glutamine have long been recognized as central nutrients, lipid metabolism has recently emerged as a critical element of this metabolic rewiring. Lipids not only provide a dense source of energy but also supply essential building blocks for membrane biosynthesis, thereby supporting proliferation and adaptation. These roles make lipid metabolism an attractive direction for identifying therapeutic vulnerabilities. Based on previous results from our group, we hypothesize that genetic-enzymatic compensations are responsible for reducing the impact of silencing genes associated with lipid metabolism reestablishing the flux. Therefore, our goal was to develop a strategy to double silence oncogene-induced tumor models in vivo via hydrodynamic transfection. As a complementary strategy, we start the develop of colon cancer organoids through sequential CRISPR editing of APC, TP53, KRAS, and SMAD4.So that the same metabolic targets could be extrapolated to other tissues. In parallel, we refined isotopetracing gas chromatography mass spectrometry (GC-MS) protocols to enable highresolution profiling of both polar and apolar metabolites in cellular and organoid system Pilot studies confirmed the feasibility of dual-shRNA constructs and demonstrated reliable induction of MYC expression in vitro, although in vivo tumor formation remains to be optimized. Colon organoids with triple and quadruple edits showed differential tumorigenicity, consistent with literature, while highlighting the need for refined implantation strategies. Importantly, we established robust isotope-tracing GC-MS protocols capable of detecting elongation products beyond C:20 fatty acids and profiling organoid metabolism. Together, these results provide methodological validation and a solid foundation for future studies aimed at uncovering compensatory mechanisms and metabolic vulnerabilities in cancer.O cancro continua a ser uma das principais causas de morte associada a doença a nível mundial. Entre os vários fatores que caracterizam a biologia tumoral, a reprogramação do metabolismo celular constitui uma das principais “hallmarks” do cancro, o qual permite que as células tumorais suportem crescimento descontrolado, proliferação contínua e adaptação a ambientes desfavoráveis. Tradicionalmente, a glucose e a glutamina têm sido identificadas como os nutrientes centrais que sustentam o metabolismo tumoral. No entanto, trabalhos recentes evidenciam a importância do metabolismo lipídico como um elemento crítico nesta reprogramação metabólica. Os lípidos fornecem não só uma densa fonte de energia, mas também a biomassa necessária para a biossíntese de membranas e moléculas de sinalização celular, as quais possuem função chave na expansão e adaptação das células tumorais. Este papel energético e estrutural, torna o metabolismo lipídico uma área promissora para a identificação de vulnerabilidades terapêuticas. Com base em resultados prévios do nosso grupo, formulou-se a hipótese de que mecanismos de compensação genético-enzimática tumorais podem reduzir o impacto do silenciamento de genes envolvidos no metabolismo lipídico, por meio do restabelecimento do fluxo metabólico e manutenção das características tumorais. Com a intenção de estudar esses mecanismos de compensação, o objetivo principal desta tese foi desenvolver estratégias experimentais que permitam a dupla silenciação de genes em modelos tumorais induzidos por oncogenes in vivo, através de transfeção hidrodinâmica em modelos murinos. Esta estratégia visa fornecer ferramentas para o estudo de compensações génico-enzimáticas verificadas em diferentes vias metabólicas estudados em nosso grupo de investigação. Nossos principais focos são o silenciamento simultâneo de genes associados à β-oxidação de ácidos gordos (CPT1a e CPT2), à elongação de ácidos gordos (família ELOVL) e à resposta ao stress metabólico (ATF6 e ATF4) em hepatocarcinomas induzidos por MYC. Como estratégia complementar, iniciámos o desenvolvimento de modelos de cancro de colon baseados em organoides, os quais foram desenvolvidos a partir do isolamento de células estaminais do cólon de murinos. Estes organoides foram alvo de edição sequencial de genes frequentemente alterados em carcinoma de colon humano, nomeadamente, APC, TP53, KRAS e SMAD4, por meio da técnica de edição génica CRISPR-Cas9. Este procedimento foi intercalado com períodos de seleção funcional, através da alteração de componentes do meio de cultura de forma a favorecer a sobrevivência e expansão de células com as alterações genéticas desejadas. A criação destes modelos permite, em paralelo, a avaliação dos mesmos alvos metabólicos em diferentes tecidos, com a intenção de, no futuro, extrapolar os resultados obtidos no modelo de hepatocarcinoma para outros tipos tumorais. Metodologicamente, estes organoides constituem uma ferramenta experimental importante, a qual permite induzir o desenvolvimento de modelos experimentais de cancro em contexto 3D com maior representatividade fisiológica do que o modelo 2D de culturas celulares, um ponto importante a ter em consideração em futuras intervenções metabólicas. (...)engMetabolismo do cancroin vivoisotope-tracing GC-MSOrganoidesshRNATransfeção hidrodinâmicamaster thesis204081904