Santos, RuiFerreira, GuilhermeÁguas, Ana Catarina Pina2021-03-172021-03-172020-05-15http://hdl.handle.net/10400.1/15247Understanding the thermodynamics of molecular interactions can give insights for rational drug design in modern pharmacology. Although a number of methods are available to evaluate the binding of biomolecules, only calorimetry can afford the complete thermodynamic characterization of these interactions, by being able to quantify their binding affinity, enthalpy and entropy. The recent field of biosensor technology provides the approach to meet the specificity and volume requirements that the conventional calorimetric techniques cannot afford. In this thesis we developed an acoustic wave biosensor coupled with a heat conduction calorimeter (HCC), the Microbalance/Calorimeter Flow Sensor (MCFS). The Quartz Cristal Microbalance (QCM) is combined with HCC in order to create a biosensing system able to simultaneous detect the immobilized biological compounds and the heat produced/consumed by the reaction between them. The direct measurement of heat and mass change provides thermodynamic and kinetic information fundamental to understand molecular interactions. During this dissertation, protocol strategies were developed for independent QCM and HCC measurements. The MCFS was built and evaluated through baseline assays, electrical calibration and test reactions. The system proved to be responsive and robust: baseline noises are 0.23 Hz, 30 nV and 4 mΩ, with a temperature control of 0.003 K. Electrical calibration revealed a 10 mV/W sensitivity and 3 μV detection limit of the calorimeter. In a later stage, (1) biotin-streptavidin binding; (2) glucose oxidase-glucose enzymatic reaction; (3) human serum albumin-warfarin interaction; (4) and single stranded DNA hybridization were tested to validate the experimental methodology. Although none of these reactions reveal a measurable calorimetric signal, streptavidin assays confirm the possibility of differential studies with a 4 ng/cm2 QCM sensitivity and a 3 ng precision. MCFS proved to be a potential asset for molecular interactions energetic studies, although its sensitivity needs to be improved. The current MCFS can be placed in the 4th level of technology demonstration, highlighting its potential as platform for innovative early drug discovery.O estudo das interações moleculares é um tema central em química e em biologia molecular. Existem vários métodos experimentais que permitem a caracterização termodinâmica completa destas reações, mas apenas a calorimetria pode ser universalmente aplicada. No entanto, a sua utilização em biologia molecular apresenta duas limitações importantes: por um lado as experiências de calorimetria são tipicamente morosas e, por outro, o facto de o calor não ser uma propriedade específica torna difícil a interpretação de resultados calorimétricos em sistemas complexos. A tecnologia de biossensores permite colmatar as questões acima, que as atuais técnicas de calorimetria não são capazes. Nomeadamente, a recente técnica da Microbalança de Cristal de Quartzo (QCM) com Calorimetria de Condução de Calor (HCC) permite ultrapassar estas limitações ao combinar um microcalorímetro com um biossensor. O biossensor confere ao calorímetro as propriedades de deteção dos seus componentes biológicos imobilizados (permitindo atribuir o calor medido especificamente à reação de interesse), assim como um rápido modo de operação (as experiências podem ser realizadas em fluxo e os resultados analisados em tempo real). O objetivo principal desta dissertação passou pelo desenvolvimento da técnica e instrumentação do protótipo Microbalance/Calorimeter Flow Sensor (MCFS), assim como a sua validação para aplicações biológicas. Neste sentido, a primeira parte do trabalho focou o desenvolvimento de metodologias experimentais para obtenção de medidas de precisão em reações complexas em solução, tanto em QCM como em HCC, de forma independente. A aplicação da técnica de QCM a soluções biológicas está sujeita a erros provocados pela viscosidade das mesmas e pela presença de eletrólitos. Estes problemas poderão ser ultrapassados recorrendo a técnicas avançadas de análise, nomeadamente análise de impedância. Neste sentido, foram realizados ensaios preliminares em QCM com proteínas marinhas (nomeadamente a Cartilage Acidic, CRTAC). Concluiu-se haver aplicabilidade do instrumento para estudar interações moleculares no contexto das aplicações marinhas, ainda que mais testes sejam necessários para aferir conclusões acerca do papel funcional específico destas proteínas nos processos em que participam. A técnica de HCC, como qualquer técnica calorimétrica, é propensa a erros sistemáticos, visto que praticamente qualquer processo é acompanhado por evolução de calor. Desta forma, soluções lipídicas foram alvo de um estudo sistemático por Calorimetria Diferencial de Varrimento, permitindo desenvolver um protocolo experimental específico para este aparelho e aferir as melhores condições experimentais. Embora este protocolo não seja totalmente transversal ao aplicado no MCFS, foram obtidas ferramentas práticas úteis (por exemplo, metodologias de aferição de performance e de interpretação de resultados) para serem aplicadas ao protótipo desenvolvido. Para eliminar as várias fontes de erro, foram propostas técnicas para contabilizar o calor envolvido em processos competitivos. Foram realizados testes de estabilidade ao aparelho, quer em ar, quer em meio líquido. Sem fluxo de soluções, o sistema apresenta grande estabilidade, com um controlo de temperatura de cerca de 0.5 μK e linhas de base com ruído inferior a 0.02 Hz e 10 nV, para os sinais de frequência e voltagem, respetivamente. Fazendo circular água pelo sistema a 250 μL/min, os ruídos das linhas de base passam a ser de 0.23 Hz, 30 nV e 4 mΩ para a frequência, voltagem e resistência, respetivamente (medida de resistência posteriormente instalada). O controlo de temperatura passou por sua vez a ser c.a. 3 mK. Foram efetuadas calibrações elétricas para aferir a sensibilidade do sistema de medição de calor. Utilizando a vibração do próprio cristal do QCM como fonte de dissipação de potência, obteve-se uma sensibilidade de 10 mV/W e um limite de deteção de 3 μV. Outras estratégias de calibração foram desenvolvidas ao longo do decorrer do trabalho, nomeadamente uma célula de fluxo com resistência de aquecimento, cuja potência dissipada pudesse ser alterada em função do estudo em curso. Este sistema foi utilizado para perceber qual o fluxo de trabalho ideal, tendo-se concluído que um fluxo de 150 μL/min é preferível para uma maior sensibilidade. Várias reações teste para avaliar o desempenho do instrumento foram propostas, nomeadamente (1) ligação biotina-streptavidina; (2) reação enzimática glucose oxidaseglucose; (3) interação albumina do soro humano-varfarina; (4) e hibridização de duas cadeias de DNA de cadeia simples. Embora não tenha sido possível observar conjuntamente os sinais de frequência e voltagem para os sistemas estudados, é de notar que a reação (1) permitiu determinar uma sensibilidade de 4 ng/cm2 para o QCM com uma precisão de 3 ng. Além disso, provou-se com este sistema a capacidade de medida diferencial do sensor QCM, uma estratégia inovadora no estudo cinético utilizando sensores piezoelétricos. Foi possível efetuar o estudo cinético da interação biotina-streptavidina, tendo-se obtido um ka de 4.0 × 10-05 M-1.s-1 e um kd de 2.9 × 10-03 s-1, valores comparáveis com resultados publicados na literatura. Relativamente à barreira encontrada na validação do protótipo utilizando sistemas biológicos, concluiu-se que está relacionada com a diferença de sensibilidades entre os dois tipos de sensores em questão. Como o cristal QCM permite a imobilização de um número de moléculas limitado, a extensão da reação não produz ou consome calor suficiente para ultrapassar o limite deteção do calorímetro. Uma vez determinado o problema, foram efetuadas melhorias no sentido de diminuir eventuais perdas de calor no percurso da solução ao longo do aparelho. Outras estratégias como o aumento da área sensível do cristal têm já vindo a ser testadas, utilizando-se para o efeito nano partículas de ouro. Acredita-se que, um aumento substancial do número de moléculas em jogo, possa permitir a obtenção de sinal correspondente ao calor pelo HCC. Vários sistemas biológicos têm sido selecionados com base na entalpia de reação (a qual se deseja ser o maior possível) e no peso das moléculas (o qual deve ser suficiente para ser detetado pela balança de cristal de quartzo) para validação do MCFS. Alguns dos sistemas a serem testados são a simples fermentação de E. coli e a complexação do bário com o éter 18-coroa (um teste comum para calorímetros). Outra estratégia para a validação do MCFS passa pelo aumento da sensibilidade do calorímetro. Prevê-se a construção de um sistema em múltiplas etapas, no qual o calorímetro a uso seja substituído por três em série, tendo cada um deles a sensibilidade equivalente à do primeiro. Para além da sensibilidade ser aumentada, a progressão do calor pode ser extrapolada para n calorímetros, permitindo assim estimar o calor libertado, mesmo que abaixo do limite de deteção do sistema calorimétrico. Embora tenham sido encontrados alguns constrangimentos ao longo do desenvolvimento deste protótipo, o MCFS prova ser um sistema rápido e aplicável aos mais diversos estudos. Embora a sensibilidade dos sensores tenha necessariamente que ser melhorada, este sistema mostra grande potencial no estudo da energética de interações moleculares. O desenvolvimento do aparelho atingiu o 4º nível de Technology Readiness Levels (validação em laboratório). Tendo em conta o progresso realizado nestes 4 anos de desenvolvimento do aparelho, considera-se que o sistema demonstra suficiente potencial para atingir a curto prazo o próximo nível de validação da tecnologia em ambiente relevante. Espera-se ainda que, com as adequadas alterações ao protótipo atual, seja possível efetuar a medição completa do perfil energético de moléculas candidatas a fármacos.engCalometriaCalorímetro de condução de calorCinéticaInteraçõesMolecularesMicrobalança de cristal de quartzoTermodinâmicadoctoral thesis101403895