Cancela, LeonorGavaia, PauloPoudel, Sunil2023-06-062023-06-062023-02-16http://hdl.handle.net/10400.1/19664Osteoporosis is characterized by abnormal bone with low bone mass and degradation of skeleton microarchitecture, thus leading to bone fragility and risk of fracture. Oxidative stress induces an imbalance in osteoblast and osteoclast activity that leads to bone degradation, consequently resulting in osteoporotic phenotype. In addition, oxidative stress is a primary cause of secondary osteoporosis caused by specific medications. Understanding the role of oxidative stress in the development of primary and secondary osteoporosis could lead to further research towards preventive and therapeutic measures to combat this significant cause of mortality and morbidity worldwide. Antioxidant supplementation has improved bone mineral density and lowered the risk of fragility fractures. While it is not experimentally evident if the antioxidant activity is the cause of this alteration. Hence, this work aimed to counteract/rescue specific medication-induced secondary osteoporosis by supplementing antioxidants on in vitro and in vivo models. In addition, to provide insights into the molecular mechanisms on medication-induced bone impairment, the transcriptome of murine osteoblasts treated with antioxidants (Resveratrol and MitoTEMPO) and pro-oxidants (Doxorubicin) alone or in combination was analyzed. RNA-Seq data revealed that osteocrin and p53 are the responsible players on doxorubicin-induced bone impairment and its reversal by resveratrol. We further studied the effect of antioxidants and pro-oxidant on osteoclast differentiation, where we found out that doxorubicin also increased osteoclast differentiation. Based on our in vitro results, we confirm the effect of Resveratrol, MitoTEMPO on Doxorubicin-induced bone impairment with the zebrafish (osteocytic bone) and seabream (non-osteocytic bone) models. Our data indicate that regular supplementation of antioxidants effectively improves overall growth, mineralization and counteracts pro-oxidant induced bone pathologies on both models. In conclusion, this work proposes that the negative effect of the specific medication (i.e., Doxorubicin) can be reversed by regular supplementation of antioxidants (i.e., Resveratrol and MitoTEMPO). Furthermore, this work also proposes osteocrin as a key responsible factor for doxorubicin-induced bone impairment, and its reversal. Osteocrin can be further exploited as a communicator molecule for crosstalk between bone and other tissues.A osteoporose é uma doença caracterizada por um osso anormal com baixa massa óssea e pela degradação da microarquitetura do esqueleto, conduzindo assim à fragilidade óssea e a um elevado risco de fraturas. Existem várias causas descritas para a origem desta condição, sendo a mais comum a osteoporose primária ou senil, provocada pelo envelhecimento e que afeta principalmente as mulheres pós-menopausa, mas também os homens idosos. Representa cerca de 95% dos casos em mulheres e 80% em homens. A principal causa da osteoporose primaria é a diminuição dos níveis de estrogénio, particularmente a rápida redução que ocorre nas mulheres durante a menopausa, embora esta diminuição também ocorra nos homens com mais de 50 anos. A deficiência de estrogênio leva à rápida perda óssea. A osteoporose secundária representa menos de 5% dos casos em mulheres e cerca de 20% em homens e é causada por diversos fatores, como doenças, distúrbios hormonais, medicação, como corticosteroides ou fármacos quimioterápicos, ou pelo consumo de álcool e drogas. Entre os mecanismos que levam ao aparecimento da osteoporose secundária, associada a tratamentos terapêuticos com medicamentos específicos, está o stress oxidativo, que induz um desequilíbrio na atividade osteoblástica e osteoclástica que leva à degradação óssea, resultando consequentemente no fenótipo osteoporótico. Compreender o papel do stress oxidativo no desenvolvimento da osteoporose primária e secundária poderia levar a uma investigação mais aprofundada no sentido de medidas preventivas e terapêuticas para combater esta causa significativa de mortalidade e morbilidade em todo o mundo. Alguns estudos mostraram que a suplementação com antioxidantes levou a melhorias na densidade mineral óssea e diminuiu o risco de fraturas de fragilidade. Embora não existam evidências experimentais para provar que a atividade antioxidante foi a causa desta alteração. Por isso, o objetivo deste trabalho visou contrariar ou recuperar a osteoporose secundária induzida por medicação específica, através da suplementação com antioxidantes, utilizando para tal a modelos in vitro e in vivo. Adicionalmente, para procurar identificar quais os mecanismos moleculares sobre a deficiência óssea induzida pela medicação, foi realizada uma análise ao transcritoma de células osteoblásticas de ratinho (MC3T3-E1) tratadas com antioxidantes (Resveratrol; RES e MitoTEMPO; MT) ou com pró-oxidantes (Doxorrubicina; DOX) sozinhos ou em combinações entre estes. Os dados da sequenciação do ARN revelaram que a osteocrina e o p53 são as moléculas intervenientes responsáveis pela deficiência óssea induzida pela DOX e estão também envolvidas na sua reversão destes efeitos pelo co-tratamento com RES. Estudamos ainda a diferenciação de células de ratinho RAW 264.7 na linhagem osteoclástica, de forma a determinar os efeitos e investigar os mecanismos da diferenciação osteoclástica induzida pelo pró-oxidante DOX. Foi utilizado o ativador de Sirt 1 resveratrol (RES) para neutralizar os efeitos induzidos pela DOX. As células RAW 264.7 foram diferenciadas em osteoclastos sob co-tratamento com DOX e RES. Foi observado que a DOX aumentou a diferenciação de osteoclastos in vitro, ao passo que o tratamento com RES inibiu a diferenciação osteoclástica induzida pelo DOX, mas tal não se verificou com MT. O tratamento com RES reduziu a expressão do marcador de fusão osteoclástica Oc-stamp e dos marcadores de diferenciação Rank, Trap, Ctsk e Nfatc1. Inversamente, o tratamento com RES induziu a sobre expressão dos genes antioxidantes Sod 1 e Nrf 2, enquanto DOX reduziu significativamente a expressão FoxM1, resultando em stress oxidativo. A utilização da linha transgénica de peixe zebra repórter para catepsina K (Tg[ctsk:DsRed]) permitiu verificar o aumento da expressão in vivo de ctsk significativamente o sinal de ctsk, enquanto o co-tratamento RES resultou numa redução significativa do número de células positivas. Adicionalmente foi observado que a exposição a RES conseguiu reverter efeitos negativos da DOX no desenvolvimento do trato intestinal, com redução da mucosite, e nos efeitos sobre o comportamento locomotor e padrão de locomoção que foram significativamente afetados no tratamento com DOX. Com base nos resultados in vitro, foi estudado o efeito do RES e MT na prevenção de malformações ósseas induzida pela DOX, utilizando os modelos de peixe-zebra (osso osteocítico) e dourada (osso anosteocítico). Estes dois modelos foram submetidos a tratamentos nutricionais com dietas suplementadas em DOX, RES e MT durante o crescimento larvar. Os nossos dados indicam que a suplementação regular com antioxidantes melhorou efetivamente o crescimento global, a mineralização das estruturas esqueléticas e contrariou a incidência e a gravidade das malformações ósseas induzidas por pro-oxidantes em ambos os modelos. Observou-se ainda uma redução da expressão de genes por ação da DOX, como os marcadores de osteoblastos (osteocalcina e osterix/sp7) e de genes antioxidantes, incluindo catalase, glutatião peroxidase 1, superóxido dismutase 1, e hsp90, sugerindo que a formação de espécies reativas de oxigénio (ROS) é central para a perda óssea induzida por DOX. A expressão dos genes antioxidantes foi significativamente aumentada pelo RES sozinho ou em tratamento combinado. Uma vez mais foi observada uma melhoria do desenvolvimento intestinal, com aumento do tamanho dos villi intestinais e redução da inflamação, tanto em peixe zebra como em dourada. Em conclusão, este trabalho propõe que o efeito negativo da medicação específica (DOX) possa ser revertido por suplementação regular com antioxidantes (RES e MT). Além disso, este trabalho propõe também a osteocrina como fator responsável pela deficiência óssea induzida pelo DOX, e a sua inversão. A osteocrina pode ser ainda mais explorada como molécula comunicadora para a conversa cruzada entre o osso e outros tecidos.engAntioxidantsPro-oxidantsOxidative stressEsveratrolMitotempoDoxorubicinOsteoblastsOsteoclastsZebrafishSeabreamOsteocrinP53Secondary osteoporosisdoctoral thesis101738919