Tavares, Álvaro Augusto MarquesBousbaa, HassanSilva, Patrícia Manuela Areias da2017-10-172017-10-172017-09-152017http://hdl.handle.net/10400.1/10103Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2017Genomic stability relies on the faithful chromosome segregation in mitosis, under the control of the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). This surveillance mechanism monitors the nature of kinetochore-microtubule attachments (KT-MT) and prevents premature anaphase onset until all chromosomes achieve proper bipolar attachments and come under tension. To initiate anaphase and promote mitotic exit, the silencing of SAC is required. In this study, we proposed to shed light into the function and regulation of the SAC mechanism and to explore its potential as therapeutic target for cancer therapy. For that, two questions were asked that define the main objectives of the present thesis: i) how SAC proteins are functionally related to motor proteins to regulate KT-MT attachments and SAC silencing? and ii) to what extent could SAC proteins constitute relevant cancer biomarkers and/or relevant targets to kill cancer cells, either alone or in combination with currently used antimitotics? We found that RNAi-mediated co-depletion of the SAC protein Bub3 and the motor protein dynein partially restored functional KT-MT attachment, otherwise severely affect by individual depletion of each of the two proteins, leading to chromosome congression. An antagonistic relationship between Bub3 and dynein is suggested to ensure stable KT-MT attachments. In addition, we demonstrated that upon chromosome alignment at the metaphase plate, the core SAC proteins Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, and Bub3 and the KMN components Hec1 and Mis12 are poleward transported by dynein, suggesting a role in SAC silencing. Second, and in a therapeutic perspective, we dissected the dual role of Spindly (kinetochore regulator of dynein), in chromosome attachment and SAC silencing, as a strategy to potentiate tumor cell killing. We found an upregulation of Spindly in human cancer cell lines and in patient samples which are correlated with tumor proliferation. Interestingly, Spindly inhibition enhanced the cytotoxic response of paclitaxel- and cisplatin-mediated chemotherapy, and sensitized human tumor cells to death. Overall, we provide new insight into the regulation of kinetochore-microtubule interactions by establishing a functional antagonistic relationship between Bub3 and dynein in regulating KT-MT attachment. Also, we provide new insight as to SAC components that are removed from the kinetochore by dynein during SAC silencing.A estabilidade genómica depende da fidelidade da segregação dos cromossomas, durante a mitose, sob o controlo do checkpoint mitótico. Este sofisticado mecanismo de controlo monitoriza o estado das ligações cinetocoro-microtúbulos e inibe o início prematuro da anafase até que todos os cromossomas estabeleçam uma ligação bipolar, através dos seus cinetocoros irmãos, com os microtúbulos provenientes de pólos opostos do fuso mitótico, culminando no seu alinhamento na placa metafásica, fenómeno designado de congressão. Nos cinetocoros não ligados ou ligados de forma incorrecta, a formação do complexo do checkpoint mitótico (MCC), constituído pela associação das proteínas Mad2, BubR1, Bub3 e Cdc20, inibe a activação do complexo promotor da anafase/ciclossoma (APC/C). A inibição do APC/C evita a degradação proteossómica dos substratos mitóticos ciclina B e securina, induzindo uma paragem na mitose e evitando a separação prematura das cromátides irmãs. Por sua vez, o início da anafase e a saída da mitose requerem o silenciamento do checkpoint mitótico. A expressão anormal de componentes do checkpoint mitótico tem sido amplamente associada a vários tipos de cancro. Assim, a mitose como alvo no tratamento do cancro emergiu como um área de rápido avanço científico e várias proteínas envolvidas na sua regulação têm vindo a ser identificadas como possíveis alvos terapêuticos. Até à data, os fármacos que afectam a dinâmica dos microtúbulos como o paclitaxel, permanecem entre os quimioterápicos mais efetivos na clínica. Ao interferirem com a instabilidade dinâmica dos microtúbulos, estes agentes levam a uma activação crónica do checkpoint mitótico que ativaria o programa de morte celular. Infelizmente, o destino das células paradas em mitose sobre ação dos agentes anti-microtúbulos varia consideravelmente entre uma população de células tumorais e algumas células saem da mitose, escapando à morte celular. Não obstante, a resistência adquirida e a toxicidade, associada aos fármacos quimioterápicos em uso, permanecem uma preocupante limitação no sucesso da terapia do cancro. Assim, torna-se urgente compreender o mecanismo através do qual estes compostos atuam e travam a progressão das células tumorais, de forma a potenciar a sua acção e/ou desenvolver novas abordagens terapêuticas. Igualmente importante é a identificação de biomarcadores específicos que promovam uma detecção precoce e um diagnóstico efectivo. No presente estudo propusemo-nos promover o conhecimento acerca da função e regulação do mecanismo do checkpoint mitótico e explorar o seu papel como potencial alvo terapêutico no tratamento do cancro. Para isso, duas questões principais foram colocadas, que definem os objetivos desta tese: (i) de que forma as proteínas do checkpoint mitótico estão funcionalmente relacionadas com as proteínas motoras dos microtúbulos, na regulação da ligação cinetocoro-microtúbulos e no silenciamento do checkpoint mitótico? e (ii) até que ponto as proteínas do checkpoint mitótico podem constituir relevantes biomarcadores e/ou alvos terapêuticos para eliminar as células tumorais, quer de forma isolada ou em combinação com os agentes anti-mitóticos correntemente em uso? Para responder ao primeiro objetivo, propusemo-nos caracterizar, em células humanas em cultura, a relação funcional entre a proteína do checkpoint mitótico Bub3 e a proteína motora dineína, na ligação cinetocoro-microtúbulos, recorrendo à técnica de RNA de interferência, a ensaios funcionais e microscopia de alta resolução. A depleção, quer da proteína Bub3 quer da proteínas dineína, originou placas metafásicas incompletas com vários cromossomas desalinhados, confirmando o papel destas proteínas na ligação cinetocoro-microtúbulos. Surpreendentemente, a depleção simultânea das duas proteínas resultou na supressão parcial do fenótipo de desalinhamento e restaurou a congressão dos cromossomas. Consistente com estas observações, as ligações cinetocoro-microtúbulos estabelecidas nas células codepletadas mostraram ser estáveis, produzindo tensão inter- e intra-cinetocoros, indicando que são funcionais. Sugerimos a existência de uma relação antagonística entre as proteínas Bub3 e dineína na regulação da estabilidade das ligações cinetocoromicrotúbulos. Ainda, propusemo-nos clarificar o papel da proteína dineína no silenciamento do checkpoint mitótico, nomeadamente no transporte de componentes do checkpoint dos cinetocoros ligados para os pólos do fuso mitótico. Recorrendo a dois ensaios de redução de ATP que mantêm a atividade motora da dineína mas que previne a libertação no pólo da proteína transportada, verificamos que os componentes do checkpoint mitótico Mad1, Mad2, Bub1, BubR1, and Bub3 são redistribuídos dos cinetocoros ligados para os pólos do fuso, pela ação motora da dineína. Esta redistribuição continua a ocorrer em células paradas em metafase, após tratamento com o inibidor do proteossoma MG-132, situação em que checkpoint deveria estar silenciado, indicando que estas células são capazes de reativar este mecanismo. Estes resultados foram corroborados “in vivo” pela observação em tempo real deste processo recorrendo a uma proteína de fusão EGFP-Bub3. Curiosamente, foi verificado que um pool das proteínas Hec1 e Mis12 é igualmente transportado pela dineína para os pólos, sugerindo uma contribuição do complexo KMN (complexo proteico necessário para o estabelecimento da ligação cinetocoro-microtúbulo) no silenciamento do checkpoint mitótico. Para responder ao segundo objetivo, e numa perspetiva terapêutica, exploramos o papel da proteína Spindly como potencial alvo terapêutico no tratamento do cancro. A Spindly é uma proteína necessária para a localização da dineína nos cinetocoros e está implicada na ligação dos cromossomas e no silenciamento do checkpoint mitótico. Inicialmente, verificamos uma sobreexpressão da Spindly quer em linhas celulares tumorais (PCR em tempo real) quer em amostras tumorais de pacientes (imunohistoquímica). Da análise imunohistoquímica verificou-se que a sobreexpressão da Spindly (+75% dos pacientes com carcinoma oral) estava correlacionada com um aumento da proliferação tumoral e com um mau prognóstico. As análises uni e multivariadas demonstraram que esta sobreexpressão constitui um indicador independente de prognóstico para a sobrevivência específica de cancro. Por outro lado, a depleção da Spindly, por RNA de interferência, revelou um aumento do efeito citotóxico de fármacos correntemente utilizados em quimioterapia, como o paclitaxel e a cisplatina, demonstrando sensibilizar as células tumorais para a morte celular. Estes resultados indicam que a supressão da Spindly poderá constituir uma estratégia válida e efectiva no tratamento do cancro. Como as concentrações utilizadas de paclitaxel e cisplatina utilizadas foram efetivamente reduzidas, esta estratégia poderá trazer benefícios clínicos, nomeadamente na superação dos efeitos secundários inerentes ao tratamento com estes fármacos. Estes resultados reforçam o potencial clinico da Spindly como um importante marcador de proliferação tumoral e o benefício de um cotratamento com paclitaxel ou cisplatina na inibição da proliferação tumoral e na indução da morte celular. Globalmente, o trabalho apresentado nesta tese contribuiu para estabelecer uma relação entre proteínas envolvidas na sinalização do checkpoint mitótico e as proteínas da maquinaria da ligação cinetocoro-microtúbulos; clarificou quais as proteínas transportadas dos cinetocoros para os pólos do fuso, pela dineína na promoção do silenciamento do checkpoint mitótico e identificou novos componentes sujeitos a este transporte; e identificou a proteína Spindly como potencial biomarcador e alvo terapêutico no tratamento do cancro, como adjuvante dos fármacos quimioterápicos em uso. Permitiu, ainda, estabelecer uma ponte sólida entre a investigação fundamental e a investigação aplicada ao relacionar aspetos da função e regulação do mecanismo do checkpoint mitótico com as implicações terapêuticas resultantes da sua modelação.engCheckpoint mitóticoInterações cinetocoro-microtúbulosBub3DyneinSpindlyTerapia anti-cancrodoctoral thesis101363168