Octocoral biodiversity in Portugal: a barcoding approach coupling long-range PCR and long-read sequencing to assemble mitochondrial genomes

Costa, Sandra Raposo

http://hdl.handle.net/10400.1/18674

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Sandra Costa_Octocoral Biodiversity in Portugal A Barcoding Approach Coupling Long range PCR and Long-read Sequencing to Assemble Mitochondrial Genomes.pdf		778.37 KB	Adobe PDF	Download

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Authors

Costa, Sandra Raposo

Advisor(s)

Coelho, Márcio A. G.

Serrão, Ester

Abstract(s)

As florestas de corais de zonas mais profundas ou de águas temperadas são caracterizadas por comunidades de elevada diversidade comummente denominadas por “florestas animais” pois são dominadas por espécies filtradoras não fotossintéticas que formam habitats tridimensionalmente complexos. Octocorallia é uma vasta e diversificada subclasse de antozoários que incluem os corais moles e gorgónias (Alcyonacea), os corais azuis (Helioporacea) e as penas marinhas (Pennatulacea). Estas espécies também apresentam um grande valor ecológico pois atuam como engenheiros do ecossistema com a capacidade de manter um habitat fornecendo abrigo e alimento para várias espécies de peixe, incluindo espécies com elevado interesse para a pesca comercial. Infelizmente os impactos antropogénicos persistem devido ao crescimento populacional exponencial e ao desenvolvimento da indústria global criando uma enorme pressão sobre estes ecossistemas marinhos. Felizmente, o nosso conhecimento tem crescido acerca da gravidade de como os impactos estão a afetar a integridade dos ecossistemas em zonas mais profundas. Tais impactos antropogénicos incluem poluição como derrames de petróleo, acidificação dos oceanos e atividade intensas de pesca. Corais, como as gorgónias, têm um crescimento lento e alta longevidade tornando-os mais vulneráveis a distúrbios no ecossistema pois apresentam uma baixa taxa de recuperação natural. Devido à sua importância ecológica, existe um grande interesse na comunidade científica de desenvolver estudos e implementar medidas de conservação e restauração destes habitats. A perda da biodiversidade, causada por impactos antropogénicos, tem sido um motivo preocupante globalmente. O desenvolvimento de ferramentas genéticas inovadores que facilitam na identificação de espécies, especialmente de espécies que são morfologicamente muito semelhantes, mas geneticamente diferentes, têm vindo a complementar os métodos de monitoração de biodiversidade existentes. A next-generation sequencing (NGS) éuma plataforma recente de sequenciação que fornece elevadas leituras de sequenciação numa única execução, pois fornecem informação rápida e massiva por sequenciação com esforços e custos mínimos em comparação com as técnicas tradicionais de sequenciação de Sanger. Esta técnica promove o aperfeiçoamento e complementação dos métodos tradicionais, mas apresenta algumas limitações. O primeiro indica que a região que é amplificada por PCR e sequenciada está limitada a um tamanho pequeno do genoma mitocondrial total como um fragmento do COI (marcador genético tradicional). O segundo indica que, para alguns grupos de invertebrados, estes marcadores genéticos mitocondriais não possuem polimorfismo suficiente para distinguir espécies próximas. Por fim, o barcoding de ADN requer uma biblioteca de referência completa e com qualidade. Estas bibliotecas contêm dados genéticos que são fundamentais para estudos ecológicos e também são ferramentas valiosas para a avaliação da biodiversidade como “eDNA metabarcoding” que posteriormente podem ser incorporados em estratégias de gestão e conservação. Alguns grupos de corais exigem um sistema de classificação baseado em informação genética que complemente a classificação através de morfológica. A utilização de genomas mitocondriais completos também tem sido uma ferramenta emergente e eficaz em taxonomia e estudos filogenéticos, pois são bastante úteis para avaliar relações filogenéticas ao nível de espécies porque têm uma taxa evolutiva muito mais rápida do que o genoma nuclear. Pois requer mais que um gene, ou preferencialmente, o mitogenoma completo para resolver relações evolutivas entre espécies. O genoma mitocondrial em antozoários, em particular na subclasse Octocorallia, exibe uma taxa de evolução molecular muito lenta em comparação com outros grupos taxonómicos. Como tal, o barcoding de ADN através da sequenciação de apenas um gene mitocondrial (normalmente o tradicional COI) é inadequado para distinguir muitas espécies de corais. A Oxford Nanopore Techniques (ONT) é uma técnica de sequenciação de terceira geração capaz de produzir longas fáceis e rápidas leituras de sequenciação. Uma tecnologia ideal para a construção de mitogenomas devido à sua capacidade de realizar leituras longas e repetitivas de sequenciação com uma contiguidade muito maior que garante a integridade da informação genética e construção completa do mitogenoma. Enquanto que os métodos tradicionais de sequenciação de mitogenomas completo, como o primer-walk (i.e., sequenciação de Sanger) sequenciam apenas um único fragmento de ADN de cada vez a um custo muito mais elevado. Para além disso, os octocorais exibem cinco ordens de genes diferentes em que podem ter arranjos de ordem genética diferentes ou existe um bloco de cinco ou mais genes que foram invertidos, ou seja, a codificação da cadeia é revertida. O objetivo geral desta tese foi desenvolver uma abordagem de sequenciação, construção e anotação de mitogenomas completos de diferentes grupos de corais com aplicação universal e que permita sequenciação em larga escala. O estudo é focado em espécies de octocorais maioritariamente presentes na costa portuguesa e alguns representantes de Scleractinians de Cabo Verde e de Espanha. Como tal, os objetivos específicos foram: 1) desenvolver primers específicos para corais para amplificar o mitogenoma completo usando dados de referências que estão disponíveis publicamente; 2) expandir as bibliotecas de referencia disponíveis através de sequenciação, assembly e anotação dos mitogenomas de espécies que existem em Portugal; 3) confirmar as ordens de genes das espécies-alvo e ver se estão em conformidade com o que foi descrito na literatura; 4) Fazer uma reconstrução filogenética com base nos dados da sequenciação do mitogenoma para inferir a localização filogenética e a afinidade genética das espécies-alvo dentro de Octocorallia, incluindo espécies que não foram identificadas de forma conclusiva com base na morfologia. A abordagem desenvolvida consistiu em desenhar primers universais que permitiram a amplificação do mitogenoma por PCR de longo alcance (produtos de PCR > 8000 pb), seguido de sequenciação com tecnologia de terceira geração, ou seja, dados de “long reads” obtidos com Oxford Nanopore Technologies. Uma vez que o genoma mitocondrial é circular, procurou-se desenhar primers em duas regiões opostas e equidistantes de maneira a amplificar o mitogenoma em duas reações de PCR, uma para cada metade da molécula. Um total de 17 mitogenomas de octocorais foram construídos com sucesso através de de novo assembly. Os mitogenomas circulares codificam 14 genes codificadores de proteínas (Nad1-6, Nad4L, cox1-3, Cytb, mtMutS, Atp6 e Atp8), dois genes de RNA ribossómico (r12S e r16S) e um RNA de transferência (trnM). Das cinco ordens de genes existentes em octocorais, foram sequenciadas espécies que representavam três tipos de organização do mitogenoma: Isidella elongata exibindo a ordem de genes B, Corallium rubrum exibindo a ordem de genes C e as restantes espécies exibiram a ordem de genes A, embora não tenhamos conseguido reconstruir o mitogenoma da Isidella elongata devido a um erro na combinação de primers durante a amplificação. A reconstrução filogenética com base em 16 genes mitocondriais permitiu inferir a localização filogenética e a afinidade genética das espécies-alvo dentro de Octocorallia, incluindo espécies que não foram identificadas de forma conclusiva com base na morfologia. Posicionamos e identificamos, pelo menos ao nível de genérico, todos os 17 mitogenomas reconstruídos na árvore filogenética de Octocorallia e recuperamos três ramos principais que correspondem a estudos filogenéticos anteriores e um ramo que aparenta ser basal ao ramo Holaxonia-Alcyoniina. Esta abordagem com sequenciação de terceira geração com a Oxford Nanopore Technology permitiu a sequenciação de “long-read” fornecendo sequenciação em larga escala de muitas amostras numa única execução de sequenciação. Essa abordagem que inclui PCR de longo alcance e sequenciação de “long-read” poderá ter a desvantagem de introduzir erros durante a amplificação (PCR), mas com elevada cobertura de sequenciação é possível escapar a esta limitação. A amplificação por PCR aumenta o número de cópias do mitogenoma do extrato de ADN purificado em multiplex juntamente com várias amostras agrupadas com barcoding. Esse processo reduz a proporção de ADN genómico (não mitocondrial) nos extratos de ADN e permite sequenciar de uma maneira bastante mais direcionada no qual permite agrupar várias amostras na mesmo processo de sequenciação. Esta abordagem possibilitou construir bibliotecas de referência completas cobrindo todos os mitogenomas, no qual melhorou assim as bibliotecas de referência disponíveis que posteriormente poderão auxiliar na avaliação da biodiversidade de corais com base no metabarcoding de eDNA (ADN ambiental). Mas o mais importante foi que esta abordagem pode ser altamente aplicável para sequenciar o mitogenoma completo de amostras ambientais (eDNA) por meio de metabarcoding. Desta forma, esta abordagem, juntamente com o eDNA, é valiosa para catalogar a biodiversidade e auxiliar na avaliação da biodiversidade e possíveis medidas de conservação.

Coral communities found either in tropical or deeper locations or in temperate waters can be classified as “marine animal forests” as they are dominated by habitat-forming suspension feeders, creating three-dimensional forest-like structures. Octocorallia is a wide and diverse subclass of Anthozoa that includes soft corals and gorgonians (Alcyonacea), blue corals (Helioporacea), and sea feathers (Pennatulacea). Their ecological importance, slow growth, and susceptibility to degradation caused by anthropogenic impacts make them vulnerable marine ecosystems. This leads to an interest of the scientific community to develop studies and implement conservation and restoration measures. Yet for many of these organisms, their identity is uncertain or debatable. The development of genetic tools that facilitate the identification of species, especially species that are morphologically identical but genetically different, has been complementing existing biodiversity monitoring methods. DNA barcoding allows high throughput multispecies identification but using sequencing of just one mitochondrial gene (typically the COI) is inadequate to distinguish many coral species. This study aims to develop an approach to barcode the mitochondrial genomes of octocorals by coupling long-range PCR with a 3rd generation sequencing platform (i.e., long-read sequencing) by designing coral-specific primers to amplify the mitogenomes, expanding the available reference library, confirming the gene orders arrangements of the target species and their placement in the Octocorallia phylogeny tree. We successfully identified and placed, at least at the genus level, all 17 reconstructed mitogenomes in the Octocorallia phylogenetic tree and we were able to identify three of the five existing gene orders within octocorals. This approach complemented and expanded the reference libraries that are applicable for eDNA metabarcoding to catalog biodiversity and assist in biodiversity assessment and possible conservation measures.