Browsing by Author "Pintor, Marc Bello"
Now showing 1 - 1 of 1
Results Per Page
Sort Options
- Implementation and validation of the analysis method for paralytic shellfish toxins (PST) by HPLC with fluorescence detection (HPLC-FLD)Publication . Pintor, Marc Bello; Leal, Joana Ferreira; Cristiano, Maria de LurdesO crescimento contínuo da população leva a um aumento da procura de alimentos. Uma opção viável é a exploração sustentável dos recursos marinhos. Nas últimas décadas, o consumo de marisco tem crescido consideravelmente. No entanto, atualmente, menos de 3% dos alimentos consumidos a nível mundial são de origem marinha. Embora os produtos do mar tenham um elevado valor nutricional, a sua qualidade é muitas vezes questionada devido à presença de substâncias nocivas para o organismo, por exemplo substâncias orgânicas tóxicas provenientes da descarga de efluentes, microplásticos, ou complexos de catiões de metais pesados. Outro problema relacionado com a exploração de alimentos de origem marinha é a proliferação de algas tóxicas, eventos conhecidos como Harmful Algal Blooms (HABs). Este fenómeno é especialmente preocupante porque estas algas servem de alimento a outros organismos marinhos, que bioacumulam as toxinas. Geralmente, as toxinas não têm efeitos nocivos para os organismos marinhos. Todavia, o seu consumo em concentrações elevadas pode ser prejudicial para os humanos. Existem várias classes de toxinas, que estão distribuídas em cinco grupos principais, com base nos seus efeitos tóxicos: envenenamento paralisante por marisco (PSP), envenenamento amnésico por marisco (ASP), envenenamento neurotóxico por marisco (NSP), envenenamento diarreico por marisco (DSP) e envenenamento por azaspirácidos (AZP). As toxinas PSP estão entre as que causam os efeitos mais graves para a saúde, podendo levar à morte. A sua estrutura é formada por um sistema tricíclico 3,4-propinoperhidropurina e dois grupos guanidina, com carga positiva nos sistemas pirimidina e imidazol. Atualmente são conhecidas mais de 50 toxinas derivadas da saxitoxina, a principal representante do grupo PSP. A análise quantitativa destas toxinas tem sido trabalhosa devido, por exemplo, às variações na polaridade associadas às diferenças nas estruturas químicas e à presença de epímeros. O método de análise mais adequado é o HPLC-FLD com derivatização pré-coluna. Esta derivatização baseia-se em reações de oxidação, utilizando peróxido para toxinas não-N-hidroxiladas e periodato para toxinas N-hidroxiladas. O trabalho descrito nesta dissertação centrou-se na implementação e validação do método HPLC-FLD para a análise de toxinas PSP. A principal diferença entre o sistema utilizado e o método oficial é o comprimento da coluna de HPLC, que é maior no sistema utilizado nesta investigação. Para cumprir o objetivo principal foram utilizados os onze materiais de referência certificados (CRMs) de toxinas PSP disponíveis no mercado: C1&2, dcGTX2&3, dcSTX, GTX2&3, Implementation and validation of the analysis method for paralytic shellfish toxins by HPLC-FLD. Page | 5 GTX5 e STX (toxinas não-N-hidroxiladas) e C3&4, dcNEO, GTX6, GTX1&4 e NEO (toxinas N hidroxiladas). Todos os padrões foram primeiramente analisados sem derivatização, para avaliar a possível presença de compostos naturalmente fluorescentes. Nenhum deles apresentou uma relação sinal-ruído (S/N) distinguível. De seguida, todos os CRMs foram derivatizados para avaliar os tempos de retenção (RT), a forma dos picos, a reprodutibilidade e os produtos de oxidação. Foram observados picos simétricos e reprodutíveis para todos eles. O número de produtos de oxidação experimentais corresponde aos teóricos estabelecidos no método oficial. Além disso, a variação do RT de cada pico foi inferior a 0,2 min, conforme exigido pelo método oficial. De seguida foram preparadas curvas de calibração das toxinas, individualmente ou em misturas, tendo sido testadas e otimizadas diferentes gamas de concentração. Para as toxinas não-N-hidroxiladas foram consideradas duas misturas: Mix 1, contendo GTX2&3, GTX5 e STX; e Mix 2, contendo C1&2, dcGTX2&3 e dcSTX. As gamas de concentração para as toxinas não-N hidroxiladas foram de 0,10-1,50 µM, exceto para a STX, que foi de 0,20-1,50 µM. A resolução dos picos cromatográficos foi superior a 1,5, exceto para C1&2-dcSTX, que foi de 1,4. No caso das toxinas N-hidroxiladas foram preparadas curvas de calibração para cada toxina individualmente. Os intervalos de concentração foram de 0,20-1,50 µM para C3&4 e GTX6, 0,35-1,00 µM para dcNEO e 0,40-1,50 µM para NEO e GTX1&4. Para cada curva de calibração foi calculado o coeficiente de determinação (R2 ). Os valores obtidos (R2 ≥ 0,998) foram sempre superiores ao exigido pelo método oficial. Foram também calculados os limites de deteção (LOD) e os limites de quantificação (LOQ), a partir de cada curva de calibração. Para as toxinas não-N-hidroxiladas os valores de LOQ variaram entre 0,04 µM (dcGTX2&3) e 0,16 µM (STX), enquanto para as toxinas N-hidroxiladas variaram entre 0,10 µM (GTX6) e 0,36 µM (GTX1&4). Para todas as toxinas, os respetivos LOQ são inferiores à concentração mais baixa da gama linear, cumprindo os critérios estabelecidos. Foi também calculado o erro relativo associado às réplicas de injeção no HPLC FLD em cada dia de análise (RSDinstrumental) e o erro relativo entre análises independentes (RSDinterbatch). Os valores obtidos dependem da toxina e da sua concentração, mas foram sempre inferiores a 3% e 25%, respetivamente, que são os limites estabelecidos pelo método oficial. Posteriormente foi preparada uma mistura com todas as toxinas e foi avaliada a sua separação através da extração em fase sólida (SPE-C18 seguida de SPE-COOH). As toxinas não-N hidroxiladas foram quantificadas após a SPE-C18 e as toxinas N-hidroxiladas foram quantificadas nas três frações obtidas na SPE-COOH. As toxinas não-N-hidroxiladas apresentaram recuperações entre os 75 e os 132%. Para as toxinas N-hidroxiladas, foi conseguida uma recuperação de 99% para a GTX6, enquanto as restantes toxinas apresentaram valores acima dos 120%, o que é explicado principalmente pela coeluição de alguns picos. Mais experiências são necessárias para otimizar estes resultados. Paralelamente à validação do método analítico, foi estudado o efeito de diferentes concentrações nitrato-nitrito e fosfato no crescimento das algas produtoras de toxinas PSP (Gymnodinium catenatum). Para tal, as concentrações destes nutrientes foram primeiramente quantificadas numa amostra de água da Ria Formosa (Algarve, Portugal), utilizando a análise de fluxo contínuo. A concentração média para o nitrato-nitrito foi de 81,1 ± 8,4 µM, enquanto as concentrações de fosfato são inferiores ao LOQ (3,2 µM). Com base nestes resultados, foram preparadas culturas de G. catenatum em duas condições diferentes: à mesma concentração de nitrato-nitrito na água previamente quantificada e ao dobro da concentração de nitrato-nitrito (e fosfato). As culturas foram cultivadas durante 14 dias, tendo-se observado uma maior taxa de crescimento na presença de maiores concentrações de nitrato-nitrito e fosfato. Por fim, as culturas foram filtradas e congeladas para futuras análises do perfil de toxinas e da toxicidade total, após a completa otimização e validação do método de análise.