Browsing by Author "Silva, Soraia Vanessa Guerreiro da"
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- Epigenetics and alternative splicingPublication . Silva, Soraia Vanessa Guerreiro da; Carmo-Fonseca, Maria; Custódio, Noélia; Maia, Ana TeresaEpigenética é a área da genética que se foca no estudo das alterações biológicas da célula que não envolvem alterações na sequência de nucleótidos do DNA. Um dos componentes da epigenética que tem vindo a ganhar interesse na comunidade científica são os RNAs longos não codificantes (do inglês long noncoding RNAs - lncRNAs) que são transcritos que contém mais de 200 nucleótidos. Estes não possuem quadros de leitura abertos (do inglês open reading frames – ORFs) e desempenham papéis biológicos importantes em diferenciação celular, pluripotência, regulação da transcrição, processamento e tradução de moléculas de RNAs. Têm sido também muito associados ao desenvolvimento de cancro, nomeadamente, na progressão tumoral e desenvolvimento de metáteses. Várias classes de lncRNAs têm sido descritas tendo em conta, maioritariamente, a localização destes transcritos no genoma em relação a transcritos com potencial codificante, os RNAs mensageiros (mRNAs). Uma classe de lncRNAs com interesse neste projecto é a dos transcritos anti-direccionais naturais (do inglês natural antisense transcripts – NAT). Estes transcritos têm a particularidade de serem codificados na cadeia anti-direccional de genes que codificam mRNAs, podendo haver sobreposição parcial com a região promotora ou com intrões. Pensa-se que poderão estar implicados na regulação da transcrição dos genes codificantes de mRNA ou na regulação da remoção dos intrões (splicing). O presente trabalho é parte de um projecto que tem como objectivo principal investigar a biologia dos lncRNAs no contexto do desenvolvimento de leucemia. Embora já exista evidências recentes que destacam a importância de lncRNAs na regulação da expressão genética, pouco se sabe sobre o seu papel na diferenciação das células T e na transformação leucémica. O objectivo final do projecto em si, é encontrar possíveis alvos para terapias direccionadas a moléculas de RNA em células cancerígenas de Leucemia Linfoblástica Aguda de células T (do inglês T-cell Acute Lymphoblastic Leukaemia - T-ALL). A metodologia proposta neste projecto combina técnicas de alta resolução de epigenómica, transcriptómica e biologia molecular com abordagens para monitorizar a síntese, tempos de semi-vida e localização sub-celular de lncRNAs. A análise está focada em precursores de células T primárias purificadas a partir de tumores do timo de ratinho e em modelos celulares de T-ALL de ratinho. O factor que diferencia e dá o carácter leucémico a estas células é a sobreexpressão do oncogene TLX3 que é considerando um dos genes mais mutados neste tipo de leucemias. No entanto, estudos anteriores mostraram que, por si só, esta sobreexpressão do oncogene não é suficiente para induzir a T-ALL, deste modo, poderão existir outros factores, tais como lncRNA, que estejam envolvidos no desenvolvimento da T-ALL. No âmbito deste estudo, foi seleccionado a partir da literatura uma lista de lncRNAs que são expressos em células T e podem ser relevantes no contexto da leucemia. Para monitorizar o tempo de semi-vida de lncRNAs realizou-se marcação do RNA nascente nas células com um pulso de incorporação (do inglês, pulse labelling) do análogo do uracilo, 4-thioridine (4sU), que é incorporado em todo o RNA sintetizado na célula durante esse pulso de marcação. Segue-se a extracção de todo o RNA da célula e purificação dos RNAs nascente marcados com 4sU, e dos pré-existentes e dos não marcados. A quantificação por RT-qPCR dos lncRNAs de interesse nas diferentes populações de RNA permite o cálculo da semi-vida desses lncRNA. Os resultados obtidos neste trabalho corroboram os dados já conhecidos de outras investigações dando validade e eficácia da técnica experimental executada. Para determinar a localização sub-celular de lncRNAs foi desenvolvido um ensaio de hibridação in situ de fluorescência com base em sondas de LNA e amplificação do sinal de hibridação das sondas com base em sistemas que utilizam métodos enzimáticos associados a fluorescência. Neste caso, os resultados não foram conclusivos, precisando esta técnica experimental ser melhorada e optimizada. Os lncRNAs que serão analisados por estes ensaios, no futuro, serão fornecidos por meio de análise bioinformática do transcritoma de células T em diferentes fases de transformação leucémica. No final deste estudo iniciou-se esta análise bioinformática com dados de sequenciação de RNA (RNA-seq) obtidos de células T não transformadas e de células T em diferentes fases de transformação leucémica Nesta análise pretendeu-se ter uma ideia geral dos lncRNAs e mRNAs que se encontram diferencialmente expressos entre fases diferentes de transformação leucémica. Os resultados preliminares desta análise sugerem que existe uma percentagem maior de mRNAs diferencialmente expressos do que lncRNAs, quando se comparam células não transformadas com células em diferentes fases de transformação leucémica. O objectivo é identificar entre os lncRNAs diferencialmente expressos aqueles que poderão ser relevantes na transformação leucémica. Estes serão alvo de estudos funcionais utilizando as técnicas optimizadas neste estudo, de modo a que se perceba o seu mecanismo de acção e se possa avaliar se têm potencial para ser alvos para terapias direccionadas.