Browsing by Author "Tavares, Evandro"
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- Live-cell FRET imaging reveals clustering of the prion protein at the cell surface induced by infectious prionsPublication . Tavares, Evandro; Macedo, J.A.; Paulo, Pedro M. R.; Sousa, Catarina; Lopes, Carlos; Melo, EduardoPrion diseases are associated to the conversion of the prion protein into a misfolded pathological isoform. The mechanism of propagation of protein misfolding by protein templating remains largely unknown. Neuroblastoma cells were transfected with constructs of the prion protein fused to both CFP-GPI-anchored and to YFP-GPI-anchored and directed to its cell membrane location. Live-cell FRET imaging between the prion protein fused to CFP or YFP was measured giving consistent values of 10 +/- 2%. This result was confirmed by fluorescence lifetime imaging microscopy and indicates intermolecular interactions between neighbor prion proteins. In particular, considering that a maximum FRET efficiency of 17 +/- 2% was determined from a positive control consisting of a fusion CFP-YFP-GPI-anchored. A stable cell clone expressing the two fusions containing the prion protein was also selected to minimize cell-to-cell variability. In both, stable and transiently transfected cells, the FRET efficiency consistently increased in the presence of infectious prions - from 4 +/- 1% to 7 +/- 1% in the stable clone and from 10 +/- 2% to 16 +/- 1% in transiently transfected cells. These results clearly reflect an increased clustering of the prion protein on the membrane in the presence of infectious prions, which was not observed in negative control using constructs without the prion protein and upon addition of non-infected brain. Our data corroborates the recent view that the primary site for prion conversion is the cell membrane. Since our fluorescent cell clone is not susceptible to propagate infectivity, we hypothesize that the initial event of prion infectivity might be the clustering of the GPI-anchored prion protein. (C) 2014 Elsevier B.V. All rights reserved.
- Mechanical cell lysis technique for plasmid recoveryPublication . Tavares, Evandro; Ferreira, Guilherme; Santos, José Leonardo dosA necessidade de grandes quantidades de plasmídeos de ADN tem vindo a aumentar, recentemente devido ao sucesso dos testes clínicos de terapia genética. A terapia genética é a transferência de material genético para o organismo humano, modificando o seu repertório genético, para fins terapêuticos1. A terapia genética abre um novo mercado, estimado em cerca de 45 bilhões de US$ até 20102. O plasmídeo é produzido pelas células e libertado através da sua ruptura. Por isso tem-se vindo a desenvolver métodos de purificação de plasmídeos em larga escala. A lise celular é um dos passos importantes e críticos na purificação de plasmídeos. Por isso, têm sido desenvolvidos e optimizados métodos de lise celular, capazes de serem usados para produção em larga escala em que permitam a libertação de plasmídeos intactos. Actualmente a lise alcalina é a técnica mais utilizada na libertação de plasmídeos. Esta técnica primeiramente desenvolvida por Birnboim et al.33, tem sido desde então empregada na purificação de plasmídeo em escala laboratorial. Este método consiste na utilização de três soluções: (i) Tris-HCl, um quelante (geralmente EDTA), e glucose usada para ressuspender a pasta celular; (ii) NaOH e um agente de solvatação, SDS (dodecilsulfato de sódio) que é a solução activa na lise; (iii) a solução de neutralização que normalmente é acetato de potássio. As proteínas sofrem desnaturação parcial e o SDS liga-se a elas misturando sua cadeia alifática ao cerne hidrofóbico das proteínas semi-desnaturadas. O ADN da bactéria não se desliga das proteínas semi-desnaturadas e é alvo de precipitação pela acção da solução (iii). O ADN genómico da bactéria é também precipitado, deixando o plasmídeo no sobrenadante. A sua conjugação com outros métodos como a lise térmica, o emprego de lisozimas, o choque osmótico, ciclos de congelação/descongelação, têm sido utilizados como forma de ter um método integrado de melhor performance. Mesmo assim, a lise alcalina tem algumas limitações como a elevada viscosidade, dificuldades na agitação, alto volume necessário para o tratamento duma quantidade pequena de plasmídeo o que torna complicado o seu emprego para produção de plasmídeos em grande escala. A lise mecânica que é empregada com sucesso na lise de células para obtenção de proteínas, não tem sido muito usada, porque as altas tensões de corte entre outros parâmetros danificam a integridade do plasmideo. A integridade do plasmídeo é muito importante uma vez que mecanismos de regulação como a USFDA(United States Food and Drug viii Administration) recomendam que haja uma razão de 90% de plasmídeo no estado superenrolado em relação às outras isoformas4. Mesmo assim o moínho de bolas foi empregado com algum sucesso na disrupção de células para libertação de plasmídeo, sendo relatado uma taxa de libertação de 90% de plasmídeos intactos, só que para 50% de lise. O sucesso na aplicação de agentes compactantes para proteger o plasmídeo, abre novas fronteiras para a aplicação da lise mecânica. Diferentes materiais químicos já foram utilizados para compactar o plasmídeo com sucesso, como álcoois, proteínas, iões divalentes e trivalentes ou polímeros catiónicos5-8. A compactação ou condensação consiste na utilização de químicos que provocam uma drástica redução do tamanho aparente das moléculas de ADN, através de neutralizações de cargas. O objectivo deste trabalho foi a utilização de lise mecânica na presença de agentes compactantes para a libertação de plasmídeos sem que a sua integridade fosse comprometida, aproveitando dessa forma a maquinaria existente utilizada na produção de proteínas. O agente compactante usado foi uma solução de cloreto de cálcio e tert-butanol, que são dois agentes compactantes mais baratos disponíveis. A sonicação foi a técnica de lise mecânica aplicada uma vez que é uma das técnicas mais agressivas para a integridade do plasmideo. Esta agressividade é provocada pela cavitação que causa a formação e actividade de bolhas de ar no meio sonicado. A alta tensão de corte gerada e a formação de radicais livres acabam por danificar o plasmídeo reduzindo-o a pequenos fragmentos ou em isoformas que não interessam. Os primeiros resultados dão prospectivas de alto potencial da aplicação desta técnica. Várias concentrações de cloreto de cálcio em 20% de tert-butanol foram testadas. O objectivo era o de encontrar uma concentração de cloreto de cálcio que para além de proteger o plasmídeo durante a lise, permitisse também que este precipitasse e ficasse no pellet com os fragmentos celularess, permitindo assim que as proteínas ficassem no sobrenadante e fossem assim eliminadas. Posteriormente os fragmentos celulares contendo o plasmídeo seriam ressuspendidos utilizando uma solução que provocasse a resolubilização do plasmídeo. Uma outra centrifugação seria feita de forma a remover os fragmentos celulares e ficar com o plasmídeo em solução. Foi possível libertar plasmídeos com uma fracção significativa no estado superenrolado. Partindo de uma amostra de 1 mL a 8,5 g/L de concentração em células, foi possível obter 7,97 μg de plasmídeo por mg de células (peso seco) a 13,82 % de pureza, o que é cerca de 4 vezes mais puro de que o que se obtém com a lise alcalina (3,95), para a mesma quantidade de plasmídeo libertado na lise alcalina (8,07 μg de ix plasmídeo por mg de células (peso seco)). Apesar disso também foi possível precipitar o plasmídeo libertado enquanto que a proteína ficava suspensa na solução, o que indica que uma grande parte de proteínas é removida sem emprego de técnicas especificas de remoção da mesma. ARN que é um dos contaminantes mais difíceis de separar dos plasmideos também é capaz de ser separado, uma vez que a precipitação de plasmídeos é muito superior à precipitação de ARN, possibilitando assim a remoção de uma quantidade significativa da mesma. Isso tudo torna os passos posteriores de purificação menos laborioso e custoso.
- Stability of protein formulations at subzero temperatures by Isochoric CoolingPublication . Tavares, Evandro; Lopes, Carlos; Silva, Joana G.; Duarte, Andreia; Geraldes, Vitor; Rodrigues, Miguel A.; Melo, Eduardo; Correia, CátiaOptimization of protein formulations at subzero temperatures is required for many applications such as storage, transport, and lyophilization. Using isochoric cooling (constant volume) is possible to reach subzero temperatures without freezing aqueous solutions. This accelerates protein damage as protein may unfold by cold denaturation and diffusional and conformational freedom is still present. The use of isochoric cooling to faster protein formulations was first demonstrated for the biomedical relevant protein disulfide isomerase A1. Three osmolytes, sucrose, glycerol, and l-arginine, significantly increased the stability of protein disulfide isomerase A1 at -20°C with all tested under isochoric cooling within the short time frame of 700 h. The redox green fluorescent protein 2 was used to evaluate the applicability of isochoric cooling for stability analysis of highly stable proteins. This derivative of GFP is 2.6-fold more stable than the highly stable GFP β-barrel structure. Nevertheless, it was possible to denature a fraction of roGFP2 at -20°C and to assign a stabilizing effect to sucrose. Isochoric cooling was further applied to insulin. Protein damage was evaluated through a signaling event elicited on human hepatocyte carcinoma cells. Insulin at -20°C under isochoric cooling lost 22% of its function after 15 days and 0.6M sucrose prevented insulin deactivation.