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- Definição dos mecanismos de polaridade celular durante a citocinesePublication . Silva, Frederica Gil Figueiredo Leitão; Florindo, Cláudia; Tavares, ÁlvaroA conclusão do processo da citocinese é o evento final da divisão celular. De forma a garantir a estabilidade genética dos organismos a citocinese não pode ocorrer antes que os cromossomas sejam fielmente segregados. Falhas neste processo são uma importante causa de instabilidade genética, ou seja, quando desregulado este processo poderá conduzir a anormalidades em organismos multicelulares, como o cancro. Durante a citocinese há a constrição do anel de actmiosina, seguindo-se a formação da ponte intercelular, na qual no meio se encontra o midbody. Este é constituído por várias proteínas que são necessárias para o início da abscisão (ex: hsMOB4A e hsMOB4B, γ-tubulina, centriolina, etc). Trabalhos anteriores do nosso grupo mostraram que as proteínas hsMOB4A e hsMOB4B são essenciais para a execução da abscisão e que quando depletadas aumentam a mobilidade celular. Muitas proteínas que se localizam no midbody, encontram-se também noutras estruturas (ex: centrossomas). Esta diversidade de localizações e funções, torna a dissecação do mecanismo citocinético complicado, sendo de difícil análise a função de cada proteína associada a uma localização celular, apenas através da técnica de RNAi. Uma técnica que permite a inactivação temporal e local é a Chromophore Assited Laser Inactivation (CALI). A base desta técnica é a inactivação local da proteína de interesse devido a geração de espécies reactivas de oxigénio (ROS) após a iluminação com um laser. Neste trabalho, foram desenvolvidas ferramentas para a realização de ensaios de CALI. Criaram-se linhas estáveis a expressar β-tubulina-SNAP-tag e γ-tubulina-SNAP-tag para otimização dos ensaios de CALI e, também, para analisar qual a função destas proteínas na abscisão. Para ensaios de CALI em conjunto com a técnica de RNAi (para deplecção da hsMOB4A e hsMOB4B endógenas) nas proteínas hsMOB4A e hsMOB4B, foram concebidos e caracterizados clones hsMOB4A e hsMOB4B resistentes ao RNAi, com o objectivo da geração de duas linhas estáveis, SNAP-tag-hsMOB4A e SNAP-tag-hsMOB4B resistentes ao RNAi, de modo a perceber qual a localização necessária destas proteínas para que ocorra o processo de abscisão. Todas estas ferramentas desenvolvidas ao longo deste trabalho, permitirão realizar ensaios de CALI nas proteínas de interesse e compreender qual a sua localização para que ocorra o evento final da citocinese, a abscisão.
- Multibiomarker assessment of cadmium-based quantum dots effects in the marine mussel Mytilus galloprovincialisPublication . Rocha, Thiago Lopes; Bebianno, Maria JoãoNanotechnology and use of engineered nanomaterials (ENMs) may improve life quality, economic growth and environmental quality, but their environmental risk in the marine environment is scarce. Properties of quantum dots (QDs), namely small size, unique optical and biofunctional properties, allow their use in nanomedicine, biology and electronics, but also confer different toxicity compared to its dissolved counterparts. Accordingly, this thesis assessed the toxicokinetics (TK), mode of action (MoA) and toxicity of CdTe QDs (10 μg Cd L-1) in the marine mussel Mytilus galloprovincialis, compared to dissolved Cd for 21 days followed by 50 days depuration. For this purpose, Cd distribution in different mussel tissues, subcellular fractions and biodeposits were analysed, TK parameters estimated (accumulation and elimination rates, bioconcentration factor and half-life time) and multibiomarkers assessed: immunotoxicity (density, viability and differential cell count of hemocytes), cytotoxicity (lysosomal membrane stability - LMS), genotoxicity (DNA damage and nuclear anomalies), oxidative stress (superoxide dismutase - SOD, catalase - CAT, glutathione peroxidase - GPx and glutatione-S-Transferase - GST), metal exposure (metallothionein - MT), oxidative damage (lipid peroxidation - LPO), tissue-level biomarkers (17 histomorphometric parameters of digestive tubules, inflammatory and histopathological conditions indices) and proteomic responses. Results showed that the digestive gland plays an important role in storage, metabolism and detoxification of QDs, while gills have similar functions for dissolved Cd and the hemolymph in transport, distribution and regulation of QDs. Tissue specific metabolism patterns and nano-specific effects were identified, wherein the MoA and toxicity of QDs in mussels is time dependent and involve oxidative stress, immune response, DNA damage and differential protein expression. Mussels were unable to completely eliminate the QDs (t1/2 > 50 days), highlighting their potential source of toxicity for human health and environment. M. galloprovincialis is a significant target of QDs ecotoxicity and represent a suitable biomonitor for assess their environment risk.