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- Pre-mRNA splicing and regulation of gene expression after Drosophila egg fertilizationPublication . Prudêncio, Pedro António Pereira; Martinho, Rui Gonçalo; Fonseca, Maria do Carmo Salazar Velez Roque daA expressão génica depende de uma coordenação complexa entre diferentes processos, os quais dependem de muitos e diferentes fatores de regulação. Devido a essa complexidade, espera-se que isso cause restrições nos estádios de desenvolvimento mais exigentes dos organismos, e vice-versa. Neste trabalho, tentamos explorar essas restrições e como influenciam a expressão genica, a relevância desses processos sob essas restrições e quão eficientes esses processos são para se adaptar sob esses estádios de desenvolvimento. Nesse sentido, decidimo-nos focar na expressão de genes zigóticos durante as rápidas divisões nucleares antes a transição da metade da blástula (MBT) do embrião de Drosophila, em que as curtas interfases limitam o tamanho dos genes aí expressos. Sabendo também que a mitose inibe no geral tanto a transcrição de genes como o seu splicing, e uma vez que a maioria dos genes expressos nesta fase não contem intrões, nós colocámos a hipótese de que provavelmente haveria também restrições no splicing nesse mesmo estádio de desenvolvimento. De acordo com essa hipótese, dois alelos mutantes para um fator de splicing nomeado fandango e homologo ao gene Xab2, uma das subunidades to complexo NTC/Prp19 em humano, foram isolados. Estes alelos apresentam defeitos na formação da blastoderme típicos de alelos mutantes de genes zigóticos. Ao analisar os transcritos expressos, reparamos que especificamente os genes zigoticamente expresses apresentavam defeitos de splicing, defeito esse, não observado nos genes transcritos maternalmente e depositados no embrião. Além disso, a expressão ectópica materna de um transcrito zigótico foi suficiente para suprimir seus defeitos de splicing no mutante de fandango. Por fim, um pequeno transcrito zigótico modificado de forma a conter múltiplos intrões apresentou mais defeitos de splicing quando expresso no embrião do tipo selvagem, comparativamente a sua expressão maternal. Mostrando assim, a existência de um pré-requisito de splicing altamente eficiente durante o estádio de desenvolvimento embrionário inicial em Drosophila. Apesar de 70% dos genes zigóticos expressos inicialmente serem curtos e não conterem intrões, a restante percentagem preserva intrões na sua arquitetura, sendo expressos durante um estádio critico para o processo de splicing. Desta forma, e uma vez que alguns destes intrões são bastante conservados entre espécies relativamente a sua posição, questionámo-nos se estes poderiam desempenhar alguma função relevante, nomeadamente durante a expressão do próprio gene. Para testar essa hipótese, fomos testar a possível funcionalidade de dois intrões conservados pertencentes a dois genes que são expressos antes da fase MBT e muito bem caracterizados: knirps (kni) e even-skipped (eve). Pare esse efeito, foram produzidas moscas transgênicas de Drosophila contendo inserções genómicas que possuíam o respetivo gene com ou sem intrão e respetivas regiões intergénicas reguladoras. Infelizmente, não foi possível obter moscas transgénicas do gene kni, não permitindo tirar uma conclusão sobre a função desse intrão nesse gene. Surpreendentemente, ambos o transgénico de eve com e sem intrão, suprimiram completamente o fenótipo de viabilidade do alelo mutante nulo do próprio gene. Além disso, não foram observadas alterações nos níveis transcritos gerados entre os dois casos, sugerindo assim não existir uma função para este intrão testado, pelo menos nas condições testadas. Para quantificar a eficiência de splicing em embriões de Drosophila, e ver se esta varia ao longo do desenvolvimento, tirámos partido da sequenciação dos transcritos em elongação nativa (dNET-seq). Esta técnica permite identificar a posição da RNA polimerase II (Pol II) com resolução de 1 nucleótido enquanto o gene esta a ser transcrito, e estabelecer a ligação dessa posição com a informação de splicing ocorrido no transcrito. Para tal foram isolados núcleos de embriões nos estádios correspondentes ao estádio MBT (early) e pós-MBT (late). A cromatina foi consequentemente digerida com Micrococcal nuclease (MNase) de modo solubilizar os complexos contento o DNA, e o RNA nascente ligado à Pol II. Estes complexos foram imunoprecipitados usando anticorpos específicos para os resíduos fosforilados, Serina 2 e Serina 5, do Domínio carboxi-terminal (CTD) de uma das subunidades da Pol II. Por consequente o RNA contido nesses complexos foi isolado, fracionado, e ligados especificamente a adaptadores de modo a garantir que unicamente os RNAs com grupo hidroxilo 3′ terminal fossem sequenciados. Desta forma foi possível observar sinal proveniente de genes zigóticos transcricionalmente ativos no embrião, enquanto que genes expressos maternalmente e depositados nos embriões, mas transcricionalmente inativos, não apresentaram sinal significativo. Mostrando assim, que o sinal detetado era especificamente proveniente de transcritos nascentes. Verificou-se também que a eficiência na terminação da transcrição estava associada à ausência de genes proximais a jusante ao gene analisado, e curiosamente, que genes pré-MBT apresentavam essas mesmas características. Enquanto que genes sem genes posicionados nos 500 pb a jusante, apresentavam pouca densidade de Pol II jusante ao sinal de terminação, genes convergentes que se sobrepõem exibiam mais Pol II a seguir a esse mesmo sinal, transcrição essa não correlacionada com a transcrição do gene convergente. Detetámos também reads abrangendo junções recursivas de splicing e entre exões em transcritos conectados ao local ativo das moléculas de Pol II posicionadas alguns nucleotídeos a jusante dos locais de splicing recursivos e canônicos 3′. Indicando que o splicing pode ocorrer logo após um local de splicing, ou seja, muito próximo do canal de saída da Pol II. Quantificando a eficiência de splicing com base no rácio entre reads spliced e reads totais detetados nos primeiros nos primeiros 100 nucleóticos a jusante do local de splicing 3′, foi possível correlacionar essa eficiência com algumas características. Entre essas características, tanto a força do sinal de splicing presente na sequência 3′, como o alto conteúdo em nucleotidos GC e o facto dos intrões não pertencerem nem à primeira nem às últimas posições, correlacionou-se com o facto de haver mais casos com evidencia de splicing imediato. Inesperadamente, enquanto bastantes intrões curtos apresentavam evidencias de splicing imediato, concordante com o mecanismo de splicing de definição de intrão, intrões muito longos, onde era esperado splicing por definição exonica também apresentaram muitos casos em que o splicing ocorrera antes da Pol II terminar a transcrição do exão. Esta observação, argumenta que a definição de exão não é obrigatória para splicing em metazoários. Por último, e além do aumento de densidade de Pol II observado na generalidade dos exões relativamente aos intrões, encontrámos ainda padrões especificos de pausa da Pol II associados aos diferentes níveis de eficiência de splicing, sugerindo um mecanismo acoplado de splicing que diminui o alongamento da transcrição. Tal como mostrado anteriormente em células humanas, dNET-seq foi capaz de detetar snRNAs pertencentes ao spliceosoma e productos intermediárias resultantes da primeira reação de splicing, mostrando uma vez mais que o spliceosoma se associa a Pol II ativa. Esses intermediários de splicicing juntamente com casos em que reads mostram a junção dos exões, permitiram concluir que 95% dos intrões analisados podem ser removidos cotranscricionalmente.
- Terapia génica: sistemas de entrega, mecanismos moleculares e abordagens terapêuticas aprovadasPublication . Biscaia, Carolina; Nobrega, ClévioDesde o reconhecimento do gene como a unidade básica do DNA, da hereditariedade e da genética, a capacidade para fazer modificações específicas no genoma humano tem sido um objetivo para a comunidade científica. A terapia génica, através da adição, silenciamento, substituição ou edição de genes, pretende modificar o prognóstico de patologias, através da inserção de ácidos nucleicos, com recurso a sistemas de entrega com características distintas, nos alvos terapêuticos correspondentes. Diversas melhorias ao nível dos sistemas de entrega (ditos vectores), quer virais, quer não virais, como métodos físicos ou químicos, têm como objetivo aumentar a eficácia e segurança, promovendo a obtenção de benefício terapêutico, com o desafio constante de evitar respostas imunes ou efeitos tóxicos indesejados. Após a descoberta de mecanismos de transferência genética através da transdução, por Ledeberg em 1952, até à primeira transferência de genes aprovada em humanos, por Rosenberg em 1989, a terapia génica já se tornou uma realidade, com cerca de 232 ensaios clínicos aprovados só em 2018 e com terapêuticas diversas, na abordagem de doenças monogenéticas, cardiovasculares, oncológicas, infeciosas e neurológicas, entre outras. A atual dissertação tem como propósito, apresentar uma revisão bibliográfica atualizada da evolução da terapia génica, analisando e comparando as diferentes metodologias de administração, sistemas de entrega e estratégias terapêuticas, bem como a abordagem de terapêuticas atualmente aprovadas, cuja implementação veio alterar o rumo clínico de determinadas patologias. Pretende-se também analisar perspetivas futuras e avanços que auxiliem o desenvolvimento de novas terapias génicas, que melhorem o tratamento e a qualidade de vida dos doentes.
- Determinação de um mínimo paremiológico do português europeuPublication . Reis, Sónia; Baptista, JorgeO principal objetivo deste estudo é apresentar o ‘mínimo paremiológico’ do português europeu, isto é, a lista dos provérbios mais conhecidos e mais frequentemente utilizados pela generalidade dos falantes da comunidade linguística do português europeu. Para o estabelecimento do ‘mínimo paremiológico’ do português europeu foram utilizados diferentes procedimentos metodológicos ao longo de cinco anos. Numa primeira fase, coligiu-se uma base de dados digital com mais de 114.000 entradas (provérbios e variantes) e fez-se uma primeira seleção manual dos provérbios considerados mais usuais, tendo-se depois calculado a concordância entre anotadores, que foi bastante elevada. Procedeu-se também ao cálculo da frequência de provérbios e variantes (n. de ocorrências) em várias fontes: (1) em dicionários e coletâneas de provérbios; (2) num corpus de textos jornalísticos (CETEMPúblico, Santos & Rocha, 2001); (3) em manuais escolares de Português e de Português Língua não Materna; e (4) em dois motores de busca (Google e Bing). Procedeu-se ainda à aplicação de dois questionários distintos, online. Obteve-se assim uma lista de 318 provérbios – o mínimo paremiológico do português europeu. A lista dos 318 provérbios poderá́ ter diversas aplicações, quer para o desenvolvimento de instrumentos de diagnóstico ou terapia de certas patologias da linguagem, quer para a aprendizagem de português como língua estrangeira.
- A caracterização da adesão a dieta mediterrânica e conhecimentos nutricionais dos idosos do AlgarvePublication . Spinelli, Adriana da Silva; Braz, NídiaA pergunta de partida da presente investigação é: “Os Idosos Algarvios possuem conhecimentos nutricioniais e são praticantes da Dieta Mediterrânica?”, porque a preservação da saúde com qualidade de vida é fundamental para o bem-estar físíco dos idosos. A finalidade do estudo aqui apresentado foi demonstrar o quanto a população idosa Algarvia tem conhecimento dos aspectos nutricionais dos alimentos e verificar se os mesmos estavam inseridos na prática da Dieta Mediterrânica. No âmbito deste trabalho, foi elaborado um estudo de campo, por uma metodologia quantitativa, que aditamos ao presente estudo descritivo e exploratório. A amostragem foi trabalhada com a população com 65 ou mais anos, abordada nas ruas Algarvias, selecionada uma amostra de 100 pessoas entrevistadas que corresponde a 0,53%, da população nesta faixa etária (65+). Os instrumentos utilizados foram o “PREvención com Dieta MEDiterránea” (PREDIMED) e o Questionário de Conhecimentos Nutricionais (QCN). Com base nos resultados, conclui-se que a visão da amostra inquirida em relação aos Conhecimentos Nutricionais e a adesão à DM, foram inesperados. Percebemos que a população estudada está distante do conhecimento básico nutricional e que a alimentação da Dieta Mediterrânica está algo esquecida e seus beneficios com a promoção da melhor saúde também estão se perdendo. Com isso a população e o governo tenderão a gastos onerosos com a manutenção medicamentosa de patologias as quais podem ser minimizadas, em suas consequências e agravamentos, com a correta utilização da Dieta Mediterrânica. Logo, perderemos o objetivo maior que é o envelhecer de maneira saudável e com qualidade de vida. Contudo estes resultados permitirão aos profissionais da área de saúde orientar a população na aquisição de produtos alimentares adequados em prol da saúde, visando a qualidade de vida e por consequência o aumento da longevidade.
- Impact of polyamide microfibers on marine organisms using Mytilus galloprovincialis as a modelPublication . Teixeira, Rafaela Paulo; Guerreiro, Pedro Miguel Guerreiro da Costa; Castro, MargaridaPlastic is a major source of pollution/contamination in the marine environment, with important impacts on organisms, trophic webs and ecosystems. A major component of these plastic derivatives are polyamide microfibers (PAMF) that originate from synthetic fabrics. Contrary to the so-called microplastics, the impacts of these microfibers on marine species has received little attention. This thesis aims at evaluating the impact of such microfibers on the physiological processes of marine organisms and its possible introduction in the food webs. To do so, Mytilus galloprovincialis served as a model, to investigate the physiological impact of PAMF. The quantities of microfibers ingested, accumulation in the digestive tract, effects on growth variables, utilization of energetic substrates and oxidative stress were studied. The experimental setup included the establishment of a system of 12 tanks distributed by 4 levels of concentration of PAPF in the water (three replicates per treatment level): 0 (Control), 30 (30 PAMF/L), 100 (100 PAMF/L) and 200 (200 PAMF/L). Sixty mussels of similar sizes (length 2- 5mm) were placed in each tank and the experiment was run over a 45-day period. At days 15, 30 and 45, 5 specimens from each tank were sacrificed to obtain information on growth (shell biometrics), weight (soft tissues and shell weight), presence of microfibers in the tissues (mantle, gills, digestive glands, oral cavity and byssus) and catalase activity (in digestive glands and gills). Mortality was registered whenever the tanks were monitored (every other day). Results indicate that the PAMF levels tested do not cause mortality in M. galloprovincialis and do not affect shell size. However, significant differences in the weight regarding the shell weight and the dry weight or organic tissue were observed, decreasing with the increase of PAMF concentration in the water. The number of fibers in the different structures was similar (maximum values around 60) with no pattern of retention of the fibers (increase with time or level of PAMF), with the exception of the digestive glands where, for the levels 30, 100 and 200, the retention of fibers increased from day 15 to 30 and then decreased to day 45. Differences in the CAT activity were observed in the digestive glands and gills, in which, overall, the antioxidant activity increased with the increase of PAMF. In conclusion the polyamide microfibers in the water where M. galloprovincialis were grown did not have a highly significant impact of its health along the 45 days of the experiment since it did not cause mortality, likely due to the high capacity of this species to acclimate and adapt. However, future studies will be conducted to better understand the impact of these plastics’ derivatives in marine organisms.