How microplastics and adsorbed pollutants affect zebrafish development

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Screening of mineralogenic and osteogenic compounds in zebrafish—tools to improve assay throughput and data accuracy

Publication . Rosa, Joana; Tarasco, Marco; J. Gavaia, Paulo; Leonor Cancela, M.; Laizé, Vincent

Bone disorders affect millions of people worldwide and treatments currently available often produce undesirable secondary effects or have limited efficacy. It is therefore of the utmost interest for patients to develop more efficient drugs with reduced off-target activities. In the long process of drug development, screening and preclinical validation have recently gained momentum with the increased use of zebrafish as a model organism to study pathological processes related to human bone disorders, and the development of zebrafish high-throughput screening assays to identify bone anabolic compounds. In this review, we provided a comprehensive overview of the literature on zebrafish bone-related assays and evaluated their performance towards an integration into screening pipelines for the discovery of mineralogenic/osteogenic compounds. Tools available to standardize fish housing and feeding procedures, synchronize embryo production, and automatize specimen sorting and image acquisition/analysis toward faster and more accurate screening outputs were also presented.

2022-08-10Journal article

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Effects of pristine or contaminated polyethylene microplastics on zebrafish development

Publication . Tarasco, Marco; Gavaia, Paulo; Bensimon-Brito, Anabela; Cordelières, Fabrice P.; Santos, Tamara; Martins, Gil; De Castro, Daniela; Silva, Nadia; Cabrita, Elsa; Bebianno, Maria; Stainier, Didier Y.R.; Cancela, M. Leonor; Laizé, Vincent

The presence of microplastics in the aquatic ecosystem represents a major issue for the environment and human health. The capacity of organic pollutants to adsorb onto microplastic particles raises additional concerns, as it creates a new route for toxic compounds to enter the food web. Current knowledge on the impact of pristine and/or contaminated microplastics on aquatic organisms remains insufficient, and we provide here new insights by evaluating their biological effects in zebrafish (Danio rerio). Zebrafish larvae were raised in ZEB316 stand-alone housing systems and chronically exposed throughout their development to polyethylene particles of 20-27 mu m, pristine (MP) or spiked with benzo[alpha]pyrene (MP-BaP), supplemented at 1% w/w in the fish diet. While they had no effect at 30 days post-fertilization (dpf), MP and MP-BaP affected growth parameters at 90 and 360 dpf. Relative fecundity, egg morphology, and yolk area were also impaired in zebrafish fed MP-BaP. Zebrafish exposed to experimental diets exhibited an increased incidence of skeletal deformities at 30 dpf as well as an impaired development of caudal fin/scales, and a decreased bone quality at 90 dpf. An intergenerational bone formation impairment was also observed in the offspring of parents exposed to MP or MP-BaP through a reduction of the opercular bone in 6 dpf larvae. Beside a clear effect on bone development, histological analysis of the gut revealed a reduced number of goblet cells in zebrafish fed MP-BaP diet, a sign of intestinal inflam-mation. Finally, exposure of larvae to MP-BaP up-regulated the expression of genes associated with the BaP response pathway, while negatively impacting the expression of genes involved in oxidative stress. Altogether, these data suggest that long-term exposure to pristine/contaminated microplastics not only jeopardizes fish growth, reproduction performance, and skeletal health, but also causes intergenerational effects.

2022Journal article

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How microplastics and adsorbed pollutants affect zebrafish development?

Publication . Tarasco, Marco; Cancela, Leonor; Bebianno, Maria João; Stainier, Didier Y. R.

A presença de microplásticos no ecossistema aquático é, nos dias de hoje, uma realidade extremamente preocupante que acarreta sérios riscos para o meio ambiente e para a saúde pública. A capacidade dos microplásticos de adsorverem poluentes orgânicos, como é o caso do benzo[α]pireno (BaP), levanta preocupações adicionais, pois cria uma nova rota de entrada de compostos tóxicos na cadeia alimentar. No entanto, o conhecimento atual sobre o impacto dos microplásticos, inalterados e/ou contaminados, nos organismos aquáticos é ainda insuficiente e requer estudos adicionais. O trabalho desenvolvido no âmbito desta tese pretende assim fornecer novos dados sobre os efeitos biológicos dos microplásticos utilizando como modelo o peixe-zebra (Danio rerio). Pequenos teleósteos, como é o caso do peixe-zebra, oferecem vantagens significativas relativamente aos modelos animais clássicos e são atualmente utilizados como organismos de primeira linha para avaliar os riscos ambientais associados aos compostos tóxicos presentes nos meios aquáticos. Estudos toxicológicos requerem o uso de materiais inertes e condições controladas, todavia, nenhum dos sistemas atualmente comercializados é adequado para avaliar o efeito tóxico dos microplásticos. Estes sistemas contêm componentes feitos de polímeros plásticos que podem libertar partículas plásticas micrométricas, lixiviar os constituintes químicos ou adsorver os compostos químicos em estudo. O sistema de aquários autônomo ZEB316 foi desenvolvido no âmbito deste trabalho com o objetivo de suprimir esta necessidade e de facultar uma solução económica e fácil de implementar que permita a realização de estudos toxicológicos de última geração. Este sistema é construído com materiais inertes e resistentes à corrosão e proporciona boas condições de alojamento através de um sistema eficiente de recirculação e filtragem da água. A avaliação dos parâmetros da água e do desempenho do crescimento dos peixes mostrou que o sistema ZEB316 oferece condições de alojamento comparáveis à dos sistemas comercialmente disponíveis. A maioria dos resultados obtidos no âmbito desta dissertação provêm da análise de imagens de microscopia de campo claro e/ou fluorescência. Embora o uso de imagens de microscopia seja comum na maioria dos laboratórios e permita obter uma quantidade considerável de informação, a análise destas imagens é geralmente um processo moroso, em parte devido à falta de ferramentas automáticas/semiautomáticas dedicadas que permitam a sua análise. Nesse sentido, desenvolvemos diversas macros para o software ImageJ, com o objetivo de reduzir o erro associado à análise pelo usuário, aumentando assim a reprodutibilidade dos dados e a padronização das metodologias experimentais. Uma vez que o foco deste trabalho está centrado no estudo da osteotoxicidade, é de salientar o desenvolvimento de um conjunto de macros específicas para esse fim e denominadas ZFBONE. Este conjunto de ferramentas permite aos usuários avaliar, a partir de imagens 2D, parâmetros morfométricos de várias estruturas ósseas (por exemplo, opérculo, raios e escamas da barbatana caudal), mas também a extensão e a intensidade das colorações específicas do osso. Além disso, outras macros foram desenvolvidas para outros fins, por exemplo, para analisar os vários parâmetros morfométricos relativos aos embriões de peixe ou para avaliar cortes histológicos. Uma vez desenvolvidos os meios e técnicas necessários para a execução dos ensaios toxicológicos, e subsequente análise dos resultados, procedeu-se à realização das várias experiências que visam compreender efeito biológico dos microplásticos e contaminates no peixe-zebra. Assim, larvas de peixe-zebra foram produzidas e mantidas no sistema previamente descrito, ZEB316, e expostas cronicamente, durante o seu desenvolvimento, a partículas de polietileno de 20- 27 μm, inalteradas (MP) ou contaminadas com benzo[α]pireno (MP-BaP). Estas partículas foram adicionadas à dieta dos peixes através de uma suplementação a 1% m/m. Apesar de não se ter registado qualquer alteração ao nível dos parâmetros morfológicos aos 30 dias pós-fertilização (dpf), a presença de MP e MP-BaP acabou por ter um efeito negativo no crescimento dos espécimes aos 90 e 360 dpf. A fecundidade relativa, a morfologia do ovo/embrião e a área do vitelo também sofreram um impacto negativo em peixes-zebra alimentados com MP-BaP. No que respeita ao estado geral do esqueleto, os peixes expostos a dietas experimentais contendo MP e MP-BaP sofreram um aumento significativo na incidência de deformações esqueléticas aos 30 dpf quando comparados com peixes alimentados com a dieta controlo, bem como um desenvolvimento anómalo da barbatana caudal e escamas, e uma diminuição da qualidade do osso aos 90 dpf. Um comprometimento da formação óssea intergeracional foi também observado na prole de espécimes expostos a MP ou MP-BaP, que se refletiu numa redução do osso opercular dos descendentes aos 6 dpf. Além de um claro efeito no desenvolvimento ósseo, a análise histológica do intestino revelou ainda um número reduzido de células caliciformes em peixes alimentados com dieta MP-BaP, um claro sinal de inflamação intestinal. Finalmente, a exposição das larvas a MP-BaP levou a um aumento da expressão de genes associados à via de resposta do BaP, ao mesmo tempo que impactou negativamente na expressão de genes envolvidos no estresse oxidativo. Os resultados obtidos indicaram um maior comprometimento do desenvolvimento ósseo no peixe-zebra quando sujeito a uma dieta contendo microplásticos contaminados com BaP (MP-BaP), por comparação com a dieta contendo microplásticos não contaminados (MP). Outros autores demostraram também que a presença de BaP afeta a formação das vértebras e o desenvolvimento generalizado do esqueleto, no entanto os mecanismos envolvidos nestes fenómenos permanecem pouco estudados. Desta forma, realizámos ensaios adicionais in vivo com o objetivo de avaliar os efeitos osteotóxicos do BaP durante o desenvolvimento e regeneração óssea em peixe-zebra. A exposição aguda de larvas de peixe-zebra entre os 3 e os 6 dpf ao BaP levou a uma redução do tamanho do osso opercular e uma diminuição quantitativa de células positivas para osteocalcina, indicando um efeito composto na maturação dos osteoblastos. Por sua vez, quando se trata de uma exposição crônica das larvas de peixe-zebra ao BaP, entre os 3 e os 30 dpf, verificou-se que o desenvolvimento do esqueleto axial é afetado, aumentando a incidência e gravidade das deformações esqueléticas. Em peixes jovens adultos, observou-se ainda que a exposição ao BaP afetou não só a mineralização dos raios da barbatana caudal e escamas recém-formados, como prejudicou também o seu padrão morfológico, fenómenos que têm por base uma remodelação óssea desequilibrada. Relativamente às análises de expressão genética de vários marcadores verificou-se que o BaP induziu a ativação das vias xenobióticas e metabólicas e impactou negativamente na formação e organização da matriz extracelular. Curiosamente, a exposição ao BaP regulou positivamente os marcadores de inflamação nas larvas e aumentou o recrutamento de neutrófilos. Uma interação direta entre neutrófilos e a matriz extracelular óssea, ou células responsáveis pela formação do osso, foi observada in vivo, o que sugere um papel dos neutrófilos nos mecanismos subjacentes à osteotoxicidade do BaP. Globalmente, os resultados obtidos no âmbito deste trabalho sugerem que a exposição crónica a microplásticos inalterados e/ou contaminados não prejudica apenas o crescimento dos peixes, mas também o seu desempenho a nível reprodutivo, saúde geral do seu esqueleto, e compromete a descendência por meio de efeitos intergeracionais. Além disso, este trabalho fornece novos dados sobre os principais mecanismos celulares e moleculares envolvidos na osteotoxicidade do BaP e aborda o possível papel dos neutrófilos na redução da resposta óssea inflamatória.

2022-04-29Doctoral thesis

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