Percorrer por autor "Domingues, Max Silva Cerdeira"
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- Zebrafish as a model to study the role of ERAP1 deficiency in Ankylosing SpondylitisPublication . Domingues, Max Silva Cerdeira; Gavaia, PauloA espondilite anquilosante (AS) é uma doença autoimune inflamatória que afeta principalmente as articulações da coluna vertebral e sacroilíacas, tendo como principal característica clínica a fusão vertebral progressiva. Esta condição resulta em dor crónica, rigidez, hipercifose e perda da curvatura lordótica, afetando significativamente a qualidade de vida dos doentes. Devido à sua natureza complexa e multifatorial, ainda não existe cura definitiva para a AS. Embora os mecanismos patológicos não estejam totalmente esclarecidos, estudos genéticos identificaram polimorfismos associados à suscetibilidade para o desenvolvimento da doença, destacando-se mutações no gene Endoplasmic Reticulum Aminopeptidase 1 (ERAP1). A proteína codificada por este gene desempenha um papel essencial na regulação do sistema imunitário, nomeadamente na maturação de péptidos antigénicos apresentados por moléculas do Complexo Principal de Histocompatibilidade de classe I (MHC-I). Perturbações na função da ERAP1 têm sido implicadas na desregulação imunológica subjacente à patogénese da AS. Neste contexto, o peixe-zebra (Danio rerio) surge como um modelo promissor para o estudo da AS, devido à elevada conservação genética com os humanos, à similaridade do esqueleto axial e à sua versatilidade para manipulação genética in vivo. O objetivo principal deste trabalho foi gerar modelos mutantes para os ortólogos do gene humano ERAP1 em peixe-zebra, erap1a e erap1b, utilizando a tecnologia CRISPR-Cas9, e avaliar se a sua perda de função induz um fenótipo compatível com características observadas na AS. Para isso, foram injetados “single guide RNAs” (sgRNAs) específicos nos embriões em estágios iniciais de desenvolvimento, visando a geração de mutações nos genes erap1a e erap1b. As mutações obtidas foram validadas por PCR, análise de heterodúplex e sequenciação. Nos mutantes do erap1a, foi identificada uma deleção de 7 nucleótidos resultando numa mutação “frameshift”, enquanto nos mutantes do erap1b foi identificada uma deleção genómica extensa, com inserção de elementos móveis, levando à perda total do gene. A caracterização fenotípica das gerações F1 revelou alterações esqueléticas sobretudo nas larvas erap1a:Δ7. Foi possível detetar fusões vertebrais, malformações e desorganização das estruturas ósseas nas larvas erap1a:Δ7, sendo que estas alterações não foram observadas nos indivíduos Δerap1b:insTE. Modelos estruturais gerados por previsão 3D (AlphaFold2/ColabFold) confirmaram que ambas as mutações resultam em proteínas truncadas severamente, que perdem a arquitetura em quatro domínios típico do ERAP1 humano, Estas alterações estruturais reforçam a hipótese de perda de função total. Adicionalmente, foram realizadas análises de expressão génica por qPCR, que demonstraram alterações significativas nos níveis de genes associados a processos inflamatórios e stress do reticulo endoplasmático, como tnfa, il1b, erap2 e erp44 nos mutantes erap1a:Δ7. Estes resultados apontam para uma possível ligação funcional entre a deficiência de erap1a e a desregulação de vias moleculares inflamatórias, similares às observadas na AS. A análise da expressão espacial e temporal dos genes erap1a e erap1b revelou padrões distintos. Foram extraídos RNAs de embriões e larvas em diferentes estágios de desenvolvimento, e foram também extraídos RNAs de diferentes tecidos de peixes adultos, e os níveis de expressão avaliados por qPCR. Ambos os genes mostraram expressão desde os primeiros estágios, contudo o erap1a apresentou uma expressão, mais continua ao longo do desenvolvimento, enquanto o erap1b revelou uma queda severa na sua expressão às 24 horas pós fertilização (hpf), mantendo este padrão nos restantes estágios de desenvolvimento, sugerindo possíveis funções complementares ou especializadas durante o desenvolvimento. Além disso, a análise da expressão espacial mostrou que o gene erap1a é altamente expresso em tecidos como as vértebras e a pele, enquanto o erap1b, apresenta altos níveis de expressão em tecidos como o intestino, e não se encontra expresso na pele e nas vértebras. Estes resultados, sugerem que estes genes podem ter funções especializadas em diferentes tecidos e na resposta imune. Adicionalmente, a alta expressão de erap1a nas vértebras e ausência de erap1b neste tecido, pode explicar o porquê de existirem alterações esqueléticas nos mutantes erap1a:Δ7 e não se terem observado tais observações nos mutantes Δerap1b:insTE. Em suma, os dados obtidos nesta tese indicam que a perda de função dos genes ortólogos ao ERAP1, em especial o erap1a, pode levar ao desenvolvimento de fenótipos esqueléticos compatíveis com manifestações observadas na espondilite anquilosante. Este modelo poderá, assim, contribuir significativamente para a compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes à AS, permitindo, no futuro, a identificação de novos alvos terapêuticos ou estratégias de intervenção.