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- Unanticipated reactivity toward nucleophilic attack in the synthesis of saccharyl-1,3,4-thiadiazolyl conjugates: structure and mechanistic insightsPublication . Guerreiro, Bruno; Carvalho, Daniel F.; Coelho, Jaime A. S.; Frija, Luís M. T.; Paixão, José A.; Cristiano, Maria de LurdesAlong with the synthetic process optimization of 3- [(5-methyl-1,3,4-thiadiazole-2-yl)sulfanyl]-1,2-benzothiazole 1,1- dioxide (MTSB), a selective copper chelator with potential interest in cancer chemotherapy, the unprecedented isolation of a novel compound, 3-(1,1-dioxidobenzo[d]isothiazol-3-yl)-5-methyl-1,3,4- thiadiazole-2(3H)-thione (BMTT), evidenced an unexpected reactivity of the starting 5-methyl-1,3,4-thiadiazole-2-thiol. To shed light into the reaction mechanisms, quantum chemical calculations were conducted at the M06-2X/def2-TZVPP/PCM- (THF)//M06-2X/6-31++G(d,p) level of theory. The results conjecture the formation of BMTT from nucleophilic attack of the nitrogen at position 3 of the thiadiazole ring, involved in an Sto-N delocalized thiadiazole-2-thiolate structure, which is thermodynamically more favorable in the presence of Na+ . Experimental assays refute a plausible concerted 1,3-sigmatropic S- to Nrearrangement of MTSB that would lead to BMTT. Hence, contradicting the nucleophilicity indices of sulfur (from thiol) and nitrogen atoms of 5-methyl-1,3,4-thiadiazole-2-thiol, it is believed that an exotic nucleophilic attack by the nitrogen at 3-position of this reagent to the sp2 carbon in position 3 of pseudo-saccharyl chloride should take place. Besides, the crystal structures of the MTSB and BMTT hybrids were investigated in detail by X-ray crystallography.
- Using ECG-derived respiration for explaining BOLD-fMRI fluctuations during rest and respiratory modulationsPublication . Esteves, Inês; Rodrigues Fouto, Ana Lúcia; Ruiz-Tagle, Amparo; Caetano, Gina; Figueiredo, PatríciaRecording physiological signals during fMRI is valuable for multiple purposes but often requires additional setup, increasing complexity and participant discomfort. This is particularly challenging in simultaneous EEG-fMRI studies, which typically already include electrocardiogram (ECG) recordings. Here, we aim to leverage the known modulation of ECG by respiration to obtain an ECG-derived respiration (EDR) signal without extra equipment. We acquired EEG-fMRI data from 15 healthy subjects during resting state and two respiratory challenges (slow-paced breathing and breath-holding), with simultaneous ECG and respiratory recordings. Multiple methods were used to extract EDR signals, and the results were evaluated by comparing them with recorded respiration and assessing the quality of physiological regressors for denoising and cerebrovascular reactivity estimation. Amplitude-based EDR methods showed lower correlations with respiration, likely due to ECG distortion in the MRI. Nevertheless, coherence analysis showed that EDR preserved the relevant spectral content. EDR-based regressors were similar to those obtained from measured respiration. Notably, a method based on heart rate variability performed best overall, yielding physiological noise correction and reactivity estimates comparable to those using recorded respiration. Our results demonstrate that meaningful respiratory information can be extracted from ECG within the MRI environment, benefiting EEG-fMRI studies when respiration cannot be reliably recorded.
- The prevalence of two known pathogens of atlantic blue crab callinectes sapidus (Rathbun, 1896) in coastal adriatic, aegean sea, and atlantic iberian coastPublication . Schott, Eric; Sćepanović, Marina Brailo; Maršić-lučić, Jasna; Pares, Olivia; Zhao, Mingli; Hrabar, Jerko; Glamuzina, Luka; Pećarević, Marijana; Grdan, Sanja; Encarnação, João Pedro da Silva; Morais, Pedro; Pešić, Ana; Cetković, Ilija; Glamuzina, BrankoIn the Mediterranean Sea, the abundance of the invasive portunid crab, Callinectes sapidus, has dramatically increased in recent years. This raises concerns about damage to ecosystems, but also offers opportunities for exploitation of a new fishery. Newly invasive species may escape from pathogens in their native range, may introduce new pathogens, or can become host to endemic pathogens. Understanding these factors is important for predicting or managing natural resources in the invaded range. Using quantitative PCR methodology, this study investigated the prevalence of two pathogens common in C. sapidus in its home range of North America: the reovirus CsRV1 and the protozoan parasite Hematodinium perezi. In crabs collected from Aegean, Adriatic, and Atlantic waters, the CsRV1 virus was not detected. In contrast, the parasite H. perezi was found in crabs from all areas except the Aegean Sea. Sequence analysis of the H. perezi ITS1 gene indicated that the strains observed are most related to genotypes already described in Europe and the Mediterranean, and not to strains from the Americas or Asia. The arrival of new species and new potential pathogens is ongoing through transfer of ballast water to the Atlantic and Mediterranean. Although systems are in place to exchange or inactivate ballast water, it is advisable to continue and expand surveillance for pathogens in introduced species, to inform management of movement of these species between regions.
- Zebrafish as a model to study the role of ERAP1 deficiency in Ankylosing SpondylitisPublication . Domingues, Max Silva Cerdeira; Gavaia, PauloA espondilite anquilosante (AS) é uma doença autoimune inflamatória que afeta principalmente as articulações da coluna vertebral e sacroilíacas, tendo como principal característica clínica a fusão vertebral progressiva. Esta condição resulta em dor crónica, rigidez, hipercifose e perda da curvatura lordótica, afetando significativamente a qualidade de vida dos doentes. Devido à sua natureza complexa e multifatorial, ainda não existe cura definitiva para a AS. Embora os mecanismos patológicos não estejam totalmente esclarecidos, estudos genéticos identificaram polimorfismos associados à suscetibilidade para o desenvolvimento da doença, destacando-se mutações no gene Endoplasmic Reticulum Aminopeptidase 1 (ERAP1). A proteína codificada por este gene desempenha um papel essencial na regulação do sistema imunitário, nomeadamente na maturação de péptidos antigénicos apresentados por moléculas do Complexo Principal de Histocompatibilidade de classe I (MHC-I). Perturbações na função da ERAP1 têm sido implicadas na desregulação imunológica subjacente à patogénese da AS. Neste contexto, o peixe-zebra (Danio rerio) surge como um modelo promissor para o estudo da AS, devido à elevada conservação genética com os humanos, à similaridade do esqueleto axial e à sua versatilidade para manipulação genética in vivo. O objetivo principal deste trabalho foi gerar modelos mutantes para os ortólogos do gene humano ERAP1 em peixe-zebra, erap1a e erap1b, utilizando a tecnologia CRISPR-Cas9, e avaliar se a sua perda de função induz um fenótipo compatível com características observadas na AS. Para isso, foram injetados “single guide RNAs” (sgRNAs) específicos nos embriões em estágios iniciais de desenvolvimento, visando a geração de mutações nos genes erap1a e erap1b. As mutações obtidas foram validadas por PCR, análise de heterodúplex e sequenciação. Nos mutantes do erap1a, foi identificada uma deleção de 7 nucleótidos resultando numa mutação “frameshift”, enquanto nos mutantes do erap1b foi identificada uma deleção genómica extensa, com inserção de elementos móveis, levando à perda total do gene. A caracterização fenotípica das gerações F1 revelou alterações esqueléticas sobretudo nas larvas erap1a:Δ7. Foi possível detetar fusões vertebrais, malformações e desorganização das estruturas ósseas nas larvas erap1a:Δ7, sendo que estas alterações não foram observadas nos indivíduos Δerap1b:insTE. Modelos estruturais gerados por previsão 3D (AlphaFold2/ColabFold) confirmaram que ambas as mutações resultam em proteínas truncadas severamente, que perdem a arquitetura em quatro domínios típico do ERAP1 humano, Estas alterações estruturais reforçam a hipótese de perda de função total. Adicionalmente, foram realizadas análises de expressão génica por qPCR, que demonstraram alterações significativas nos níveis de genes associados a processos inflamatórios e stress do reticulo endoplasmático, como tnfa, il1b, erap2 e erp44 nos mutantes erap1a:Δ7. Estes resultados apontam para uma possível ligação funcional entre a deficiência de erap1a e a desregulação de vias moleculares inflamatórias, similares às observadas na AS. A análise da expressão espacial e temporal dos genes erap1a e erap1b revelou padrões distintos. Foram extraídos RNAs de embriões e larvas em diferentes estágios de desenvolvimento, e foram também extraídos RNAs de diferentes tecidos de peixes adultos, e os níveis de expressão avaliados por qPCR. Ambos os genes mostraram expressão desde os primeiros estágios, contudo o erap1a apresentou uma expressão, mais continua ao longo do desenvolvimento, enquanto o erap1b revelou uma queda severa na sua expressão às 24 horas pós fertilização (hpf), mantendo este padrão nos restantes estágios de desenvolvimento, sugerindo possíveis funções complementares ou especializadas durante o desenvolvimento. Além disso, a análise da expressão espacial mostrou que o gene erap1a é altamente expresso em tecidos como as vértebras e a pele, enquanto o erap1b, apresenta altos níveis de expressão em tecidos como o intestino, e não se encontra expresso na pele e nas vértebras. Estes resultados, sugerem que estes genes podem ter funções especializadas em diferentes tecidos e na resposta imune. Adicionalmente, a alta expressão de erap1a nas vértebras e ausência de erap1b neste tecido, pode explicar o porquê de existirem alterações esqueléticas nos mutantes erap1a:Δ7 e não se terem observado tais observações nos mutantes Δerap1b:insTE. Em suma, os dados obtidos nesta tese indicam que a perda de função dos genes ortólogos ao ERAP1, em especial o erap1a, pode levar ao desenvolvimento de fenótipos esqueléticos compatíveis com manifestações observadas na espondilite anquilosante. Este modelo poderá, assim, contribuir significativamente para a compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes à AS, permitindo, no futuro, a identificação de novos alvos terapêuticos ou estratégias de intervenção.
- Abordagens terapêuticas na doença de Parkinson: intervenção do farmacêuticoPublication . Baião, Jéssica Sofia Rodrigues; Matos, Carlos Adriano Albuquerque Andrade deA doença de Parkinson (DP) é uma patologia neurodegenerativa, de origem idiopática que afeta o sistema nervoso central, conduzindo a uma deficiência do neurotransmissor dopamina e a uma deposição/acumulação da proteína ɑ-sinucleína no tecido nervoso. Trata-se de uma doença de progressão lenta, que se pode manifestar através de sintomas motores (bradicinesia, rigidez, tremor de repouso, instabilidade postural) e não motores (depressão, distúrbios do sono, incontinência). O número de casos de parkinsonismo tem vindo a aumentar significativamente ao longo dos anos, sobretudo nos países mais desenvolvidos. A sua epidemiologia varia consoante a localização geográfica, sendo que na Europa estima-se que o número de casos esteja entre os 257 a 1400 doentes por 100 mil habitantes. A presente dissertação tem como objetivos caracterizar a DP, a sua fisiopatologia e epidemiologia, identificar as especificidades dos fármacos utilizados nesta patologia, explorar superficialmente as abordagens não farmacológicas e entender de que forma é que o farmacêutico pode intervir nestes casos, contribuindo para um aumento da qualidade de vida dos doentes. Nos indivíduos diagnosticados com DP, a abordagem terapêutica baseia-se essencialmente na reposição farmacológica dos níveis de dopamina ou na estimulação direta dos recetores dopaminérgicos. No entanto, o uso prolongado destes fármacos tende a perder eficácia. Em fases mais avançadas da doença, as opções terapêuticas eficazes são limitadas e, até ao momento, não existe tratamento capaz de impedir ou retardar o processo neurodegenerativo. Assim, a intervenção do farmacêutico na terapêutica da DP assume uma enorme importância, de forma a garantir que o plano terapêutico está a ser cumprido, avaliando a adesão à terapêutica e a eficácia do tratamento.