Browsing by Author "Lima, Mariana da Silva"
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- Thermotolerance acquisition in industrial microalgal strains to sustain growth in environments under climate changePublication . Lima, Mariana da Silva; Varela, João Carlos Serafim; Schüler, Lisa MaylinAs microalgas e as cianobactérias constituem um grupo diversificado de organismos, predominantemente fotossintéticos, que podem ser encontrados em diversos ambientes e desempenham um papel crucial nos ecossistemas aquáticos. Como produtores primários, as microalgas não só estão na base das cadeias alimentares de vários organismos, como contribuem significativamente para a produção global de oxigénio e para a fixação de dióxido de carbono. Além disto, possuem um perfil bioquímico rico, produzindo compostos com propriedades antioxidantes, antibacterianas, antivirais e outras propriedades bioativas, o que as torna valiosas para as indústrias farmacêutica, cosmética, alimentar e dos biocombustíveis. Dentro das microalgas, as diatomáceas representam um dos maiores grupos, com mais de 20.000 espécies. Consistem em organismos eucarióticos unicelulares, do filo Bacillariophyta, e estão amplamente distribuídos nos ambientes aquáticos. Uma característica peculiar destas microalgas são as suas paredes celulares porosas de sílica, denominadas frústulas, que apresentam padrões específicos para cada espécie. Em relação à sua composição bioquímica, as diatomáceas são ricas em proteínas, ácidos gordos (nomeadamente em ácido eicosapentenóico [EPA] e ácido docosahexenóico [DHA]), polissacáridos (crisolaminarina) e carotenoides (fucoxantina), tornando-as organismos de grande interesse comercial para várias indústrias. No que toca à sensibilidade às temperaturas, as diatomáceas têm preferência por temperaturas mais baixas, sendo a primavera a estação mais favorável ao seu crescimento. A sensibilidade destes organismos ao aumento das temperaturas constitui uma limitação ao seu cultivo, principalmente em sistemas abertos. Com as projeções a apontarem para um aumento de 1,8 ºC a 4,0 °C até ao final do século, as diatomáceas ficam suscetíveis aos efeitos das alterações climáticas. Este fenómeno provoca uma redução das taxas de crescimento e da produtividade, além de alterações no perfil bioquímico das algas, podendo culminar na morte celular. Neste sentido, o melhoramento de estirpes surgiu como uma ferramenta biotecnológica que permite melhorar características de interesse nos organismos, obtendo assim estirpes com maior resistência ao stress térmico. As duas principais estratégias para o melhoramento de estirpes são a engenharia genética/metabólica e a mutagénese aleatória. A engenharia genética envolve edições específicas do genoma para melhorar as caraterísticas, enquanto a mutagénese aleatória expõe as microalgas a agentes mutagénicos químicos ou físicos, como o metanossulfonato de etilo (EMS) ou radiação ultravioleta (UV), capazes de provocar alterações irreversíveis em vários locais do seu genoma. A mutagénese aleatória consiste num método robusto, fácil de executar e económico para gerar estirpes melhoradas e apresenta uma série de vantagens comparado à engenharia genética. Primeiramente, a mutagénese aleatória não requer um conhecimento prévio do genoma e das vias biossintéticas do organismo. Além disso, os mutantes gerados não estão sujeitos aos mesmos regulamentos rigorosos que os organismos geneticamente modificados na indústria alimentar na Europa e em muitas outras regiões, uma vez que não contêm qualquer ADN exógeno integrado no seu genoma. Após a mutagénese, os mutantes são selecionados para as caraterísticas desejadas, como a resistência ao calor ou o aumento da produção de compostos de interesse, através da aplicação de stress abiótico (por exemplo, temperatura, salinidade e pH) ou inibidores de vias metabólicas (como a difenilamina [DPA], a nicotina, o norflurazon, e a cerulenina). A citometria de fluxo é uma ferramenta sensível e precisa para análise de alto rendimento das propriedades individuais das células, revelando ter um grande potencial na investigação das microalgas. Esta tecnologia permite a seleção e isolamento eficaz de mutantes com caraterísticas específicas, como por exemplo para aumento da produção de compostos. Adicionalmente, através do uso de corantes fluorescentes, é possível fazer uma avaliação rápida da viabilidade celular com base na integridade da membrana ou na atividade metabólica da célula. A dissertação teve dois objetivos principais: o primeiro, isolamento de estirpes termotolerantes da diatomácea Phaeodactylum tricornutum via mutagénese aleatória; e o segundo, expansão do conhecimento sobre a relação entre a aquisição de termotolerância em diatomáceas e a salinidade do meio. Para além dos objetivos já referidos, a dissertação procurou avaliar possíveis melhorias na qualidade e valor da biomassa em resultado do stress imposto. Devido à dificuldade de cultivo de P. tricornutum em meio sólido, foi ainda avaliada a eficácia do uso da fluorescência da clorofila como forma de medição da viabilidade das microalgas cultivadas em meios líquidos. Deste modo, duas estirpes de P. tricornutum – a estirpe selvagem (WT) e um mutante previamente isolado (MT009) – foram expostas a diferentes salinidades (5, 20 e 35 ppt) e temperaturas (20, 28, 30, 35 e 40 ºC). Estes ensaios de crescimento foram realizados em de Erlenmeyer de 250 mL e, posteriormente, foi realizado o scale-up para biorreatores de 1 L, equipados com um sistema de arejamento. Na etapa de scale-up apenas as condições de 20 ºC/20 ppt, para os controlos WT e MT009, e 28 ºC a 5, 20 e 35 ppt, para a estirpe MT009, foram testadas. A biomassa das diferentes condições de crescimento obtida do ensaio em biorreatores foi posteriormente analisada bioquimicamente, nomeadamente o seu perfil de macronutrientes (proteínas, lípidos, carboidratos e cinzas), de pigmentos (clorofila a e carotenoides) e de ácidos gordos. Para alcançar o primeiro objetivo, foi efetuada a mutagénese aleatória com EMS (100, 150, 200, 250, e 300 mM), seguida de seleção de mutantes através da resistência ao stress térmico (30 ºC) e concentrações de DPA sub-letais (50, 60, e 70 μM). O ensaio da viabilidade celular foi realizado em microplacas de 24 poços e foi dividido em duas experiências, nas quais foram usadas diferentes concentrações de EMS (200, 250, 300, e 350 mM) e DPA (25, 50, 100, 300 e 400 μM) para induzir a perda de viabilidade de culturas de P. tricornutum WT. A fluorescência da clorofila destas culturas foi medida através de dois equipamentos: leitor de microplacas e citómetro de fluxo. Após três dias de exposição aos agentes citotóxicos, as culturas foram coradas com dois corantes de fluorescência (diacetato de 5(6)-carboxifluoresceína [CFDA] e SYTOX Orange) para contagem celular por citometria. A estirpe MT009 demonstrou maior resistência ao calor em temperaturas sub-letais (28 ºC) e letais (30 ºC), com as culturas a 35 ppt a manter 60% da atividade fotossintética, comparado com 10% nas culturas de 5 e 20 ppt. A maior acumulação de biomassa (1,4 g L-1), foi obtida pelas culturas MT009 a 20 e 35 ppt, a 28 ºC, nos ensaios em biorreactores. MT009 a 35 ppt teve as maiores taxas de crescimento (0,109 ± 0,011 d-1) e produtividade (0,104 ± 0,015 g L-1 d-1). Em relação às análises bioquímicas, a cultura MT009 5 ppt/ 28 ºC teve um teor proteico significativamente superior ao controlo (T4 - 33,91 ± 0,94 % DW vs. 29,09 ± 0,68 % DW; T8 - 37,93 ± 0,85 % DW vs. 31,40 ± 0,67 % DW). O conteúdo de lípidos e cinzas não apresentou diferenças significativas, mas a concentração de glícidos a 5 ppt/28 ºC (25,09 ± 0,95 % DW) foi maior que a da cultura a 35 ppt (19,95 ± 1,10 % DW). No que respeita aos pigmentos, o MT009 a 5 ppt/ 28 ºC apresentou os níveis mais baixos de clorofila a, fucoxantina e carotenóides totais, com concentrações reduzidas para metade do valor do inóculo inicial. Quanto aos ácidos gordos, verificou-se uma redução significativa dos ácidos gordos polinsaturados (PUFAs) na cultura MT009 5 ppt/ 28 ºC (38.16 ± 3.41 % of total FAME) comparado ao inóculo inicial (48.84 ± 0.08 % of total FAME). O conteúdo de EPA foi maior nas culturas a 20 ºC. A 28 ºC, a concentração de ácidos gordos saturados (SFAs) aumentou. No que diz respeito ao isolamento de mutantes termotolerantes, embora se tenham formado colónias a 30 ºC, o fenótipo termotolerante foi perdido após o primeiro subcultivo. No ensaio da viabilidade celular, verificou-se uma forte correlação entre os diferentes métodos de determinação da viabilidade das culturas, validando a fluorescência da clorofila como um indicador eficaz da viabilidade celular em culturas líquidas. Em geral, o estudo permitiu compreender fatores chave envolvidos na aquisição de termotolerância, pelas diatomáceas, e avaliar o impacto das condições de stress sobre a qualidade e valor da biomassa. Embora não tenham sido obtidos mutantes termotolerantes via mutagénese aleatória, o método é promissor, quando otimizado para a espécie. Além disso, validou-se o uso da fluorescência de clorofila, medida por espectrofotometria ou citometria, como uma técnica eficaz e prática para avaliar a viabilidade celular em culturas líquidas.