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Browsing FCB1-Teses by Field of Science and Technology (FOS) "Ciências Naturais::Outras Ciências Naturais"
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- Establishment of a protocol for the cryopreservation of cell sheets of adipose tissue stem cellsPublication . Prata, Fábio Emanuel Pires Aibéo; Marques, Alexandra P.; Tiscornia, GustavoA Engenharia de Tecidos é uma área interdisciplinar da Medicina Regenerativa que visa criar e desenvolver substitutos biológicos para reparar, manter ou melhorar a função de tecidos lesados, com base em princípios da engenharia conjugados às ciências da vida. A Engenharia de Tecidos tira partido das propriedades de estruturas tri-dimensionais (3D) que combinadas com células estaminais pretendem recriar um ambiente semelhante ao nativo de um tecido. Estas estruturas 3D (scaffolds) são produzidas com materiais de origem natural ou sintéticos, que idealmente terão as propriedades físicas, mecânicas e químicas para promoverem o melhor desempenho dessas células e portanto a regeneração dos tecidos. Na última decada as células estaminais mesenquimais foram amplamente utilizadas na Engenharia de Tecidos, pois têm o potencial de proliferarem e se manterem indiferenciadas com a capacidade de se auto-renovarem e/ou diferenciarem em diferentes tipos de células. Existem várias fontes de células estaminais com caracteristicas diferentes utilizadas em TE, em que as que apresentam maior impacto são as derivadas da medula espinal, do sangue e do tecido adiposo, entre outras localizadas em diferentes zonas do corpo humano. A combinação entre scaffolds e células estaminais mesenquimais apresentam algumas limitações tais como a indução de uma resposta inflamatória após transplante e o facto da grande maioria dos biomateriais utilizados não serem biofuncionais. A Engenharia de Cell sheets é a alternativa, pois utiliza a matriz extracelular depositada pelas células como scaffold natural para a regeneração de diferentes tecidos. O conceito de cell sheet foi introduzido por Teruo Okano e os seu colaboradores nos anos 90 no Japão. Estas cell sheets são produzidas em superficies revestidas com um polímero não iónico sensível à temperatura. Quando a temperatura é inferior a 32ºC a superficie fica hidrofílica, promovendo o destacamento das células em folha (cell sheets) sem recorrer ao uso do tradicional tratamento enzimático. Assim, esta tecnologia permite obter cell sheets com uma organização celular própria e coesiva, dado que as interações célula-celula e célula-matriz extracelular são mantidas. Em estudos anteriores no nosso laboratório foram produzidas cell sheets a partir das células estaminais humanas derivadas do tecido adiposo (hASCs). As cell sheets de hASCs quando transplantadas para feridas excisionais em pele de ratinho, induziram a formação de cristas epiteliais, normalmente apenas encontradas em pele humana, e a formação de um número significativo de folículos pilosos. Tendo em consideração estes resultados e antevendo as possibilidades de ter estas cell sheets disponiveis para uso imediato na clínica (off-the-shelf) a sua criopreservação seria vantajosa. Assim, o objectivo deste estudo foi definir um método de criopreservação que não só permita a preservação da viabilidade das hASCs mas também a integridade da matriz extracelular das cell sheets, que se sabe ser critico para garantir a sua funcionalidade, após transplantação. De modo a minimizar um potencial efeito adverso do processo de criopreservação, o método testado teve como base o método standard slow cooling rate, utilizado na criopreservação de células em suspensão. Foram então definidas duas condições de criopreservação, a condição standard, com 10% do crioprotector Dimethylsulfoxide (DMSO), e a condição exprimental, com 5% DMSO. Com o objectivo reduzir a toxicidade para as células criopreservadas. O efeito das condições de criopreservação na viabilidade celular foi analisado depois das cell sheets serem dissociadas, tendo sido demonstrado que ambas as condições de criopreservação não afectam de forma significativa a viabilidade celular. No entanto, verificou-se que a organização do citoesqueleto das células na cell sheet sofreu alterações depois da criopreservação em ambas as condições, verificando-se uma desorganização mais acentuada na condição standard. Verificou-se ainda que ambas as condições de criopreservação afetam a integridade da matriz extracelular das cell sheets, embora pareça que a condição standard afecte de um modo mais significativo. Mais ainda ambas as condições de criopreservação afectaram a quantidade total de proteínas. Potencialmente, este resultado está associado com as proteínas da matriz laminina, fibronectina e colagéneo I. De facto, a expressão destas proteínas excepto o colagéneo foi afectado tanto a nível molecular e proteico. Mais ainda verificamos a expressão dos seus genes por reacção em cadeia da polimerase (PCR). Onde a nível molecular o gene da laminina está sobre expressa em ambas as condições de criopreservação, o gene da fibronectina apenas na condição exprimental e o gene do colagéneo não sofre alterações significativas em ambas as condições de criopreservação. Considerando que as propriedades mesenquimais das células que compõe as cell sheets, são determinantes nos resultados previamente observados, a expressão dos marcadores típicos após a criopreservação foi analisado a nível genético e proteico, usando PCR e citometria de fluxo respectivamente. Com base nos resultados obtidos, que demonstram que a matriz extracelular é significativamente afectada pelo processo de criopreservação, será necessário testar diferentes protocolos e diferentes métodos de criopreservação, no sentido de se obter uma melhor preservação da integridade estrutural da cell sheet, e portanto garantir a sua funcionalidade após transplantação.