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- Study of the antimicrobial and antioxidant effects of propolis extracts, a type of Algarve portuguese originPublication . Oliveira, Ana V.; Miguel, Maria Graça; Ferreira, Ana LuísaIn this work, extracts (aqueous, ethanolic and methanolic) of propolis harvested at two different times (winter and spring) from several locations of the Algarve region (B. N. Arrodeios, B. N. Pé da Serra, B. S. Arneijoafra and T. N. Madeira) were tested for their biological activities and composition. Results showed that propolis extracts were active against both Gram-positive and Gramnegative bacteria. All tested strains of bacteria showed susceptibility to the diluted propolis extracts (1:10) and in the majority of cases in a dose-dependent way. Most propolis samples collected at springtime showed higher antibacterial activity, in comparison with samples harvested at wintertime. There were also observed differences between collection sites and type of extract. These results correlate to HPLC results, where the same differences where observed. Regarding propolis citotoxicity, results showed that aqueous propolis extracts have no effect and ethanolic propolis extracts causes a small decrease in cell viability. Concerning antioxidant enzymatic activities, the superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and guaiacol peroxidase (GP) activities of samples of propolis were determined. Results showed that SOD activity was dependent on the collection time and decreased drastically from winter to spring in samples from B.N. Arrodeios and B.S. Arneijoafra. The opposite was observed in samples from B.N. Pé da Serra and T.N. Madeira. We expected that the samples with higher SOD activities would have higher CAT activities also. Such was not observed, which may suggest that there could be other antioxidant enzymes involved, different to the ones tested. In respect with protein contents, major differences were not observed when comparing samples collected at different times, except for samples from B.S. Arneijoafra, where a decrease occurred from the sample collected at winter to sample collected at spring time. This was the first study of the biological activities of Portuguese propolis from the Algarve region.
- Estudo do papel desempenhado pelas quimiocinas na leucemia linfoblástica aguda das células TPublication . Silva, Ricardo Cabrita da; Santos, Nuno Rodrigues dosA leucemia linfoblástica aguda das células T é uma neoplasia que afecta um terço das crianças diagnosticadas com cancro e até hoje não existem certezas da sua origem. As quimiocinas são moléculas com capacidade quimioatractiva e estão associadas a processos biológicos tais como migração, desenvolvimento e transmigração.
- The activity of Mouse cerberus like 2 during cardiogenesis: genetic and morphogenetic studiesPublication . Araújo, Ana Carolina; Belo, José AntónioThe heart is the first organ that becomes functional in the vertebrate embryo. Heart morphogenesis is a complex process, with precise control developmental mechanisms, that can nevertheless fail. There are morphological aspects as polarity of the heart intrinsically related with the three body axes, anterior?posterior (A-P), dorsal?ventral (D-V), and left?right (L-R). The L-R axis has became subject of many studies in recent years and was found that the heart undergoes multiple morphogenetic processes, which are governed by this axis. Development of internal organs proceeds across the L-R axis and gain shape during organogenesis as a result of the early asymmetric activation of the conserved Nodal signalling cascade, in the left lateral plate mesoderm (Hamada et al., 2002). A Cerberus/Dan family member, mouse cerberus-like2 (cerl-2) is asymmetrically expressed on the right side of the mouse node and encodes for a secreted protein that binds directly to nodal restricting the Nodal signalling pathway towards the left side by preventing its activity in the right side (Marques et al, 2004). Preliminary studies showed that cerl-2 knockout (KO) mice display multiple laterality defects including heart?s rotation failure and randomization of organs? position due to L/R axis disruption. In addition, was observed several cardiac defects as severe hyperplasia of the myocardium and incomplete atria formation and ventricular septation that may not be explained by laterality abnormalities. In this study, were conducted morphological analyses of cerl-2 KO newborns, histological sections of newborn hearts and WISH with Gata-4, mefc2, hand and fgf8 probes on embryos throughout heart development (7,5dpc to 10.5dpc). Furthermore, a new compound mouse line cerl- 2KO::mlc1vlacZ was generated which will help to identify the contribution of the Secondary Heart Field (SHF) to the cerl-2KO heart defects. This body of work leads to the suggestion that, in addition to the previously described laterality-related defects, another distinct mechanism may contribute to the spectrum of complex cardiac defects in cerl-2 KO mice that cannot be explained only by the disruption of the nodal cascade in LPM. Problems in heart morphogenesis lead to congenital heart disease, which is the most common form of birth defect in humans (Harvey, 2002; Olson and Schenider, 2003). Abstract
- The effect of alpha-ketoglutarate on a piscine skin model: a molecular and morphological studyPublication . Costa, Rita; Power, DeborahAlpha-ketoglutarate (AKG) is a key intermediate in the tricarboxylic acid cycle with important functions in glutamate and glutamine metabolism. Its effect after oral administration was studied in adult sea bream Sparus aurata skin and scales in order to evaluate the effect on collagen synthesis. Scales were removed from one side of the body and allowed to regenerate for 14 days; the control group received untreated food, the AKG (calcium salt) group received 0.1g/kg in the diet (Gramineer International AB) and the placebo group received food treated with 140 mg calcium pills. AKG administration did not affect cortisol, estradiol, calcium or phosphorus levels in sea bream plasma, but the levels of aspartate-aminotransferase (AST) were higher in the AKG treated group when compared to the Control. AKG administration did not modify the overall organisation of the sea bream skin or of scale regeneration, as observed after tissue staining with Masson’s Trichrome. However, in the epidermis of the AKG treated group, the basement membrane was thicker than in the other groups both in the intact and regenerated scale, as revealed by birefringence under polarized light, which revealed a strong yellow band corresponding to collagen type I that was not observed in the control or placebo groups. Scale osteoblasts were identified by in situ hybridization with specific riboprobes and osteoclasts by TRAP staining and the content of ColIα1 and osteopontin in intact and regenerating skin was evaluated by qPCR. No differences in the expression of these two genes were observed between experimental groups, but an adequate reference gene still needs to be identified. Assessment of the elastic recoil of aortas from each experimental group revealed it was significantly higher in the AKG group compared to the control and this modification in rats was associated with an increase in collagen synthesis. This is in agreement with the increase in collagen detected in the skin by birefringence under polarized light in AKG treated fish although this observation will require confirmation by quantification of the collagen. In conclusion, the results of the present study provide evidence that AKG administration modifies collagen synthesis in sea bream. Further studies are required to confirm the effect of AKG on collagen synthesis and its mechanism of action during skin and scale regeneration.
- Identification of the molecular alterations of the thymic environment that favor the onset of T-cell acute lymphoblastic leukemiaPublication . Ghezzo, Marinella; Santos, Nuno Rodrigues dos
- Functional study of AVE secreted genes during mouse embryogenesis: insights on the role of mADTK1Publication . Silva, Lisa Gonçalves Dias da; Belo, José AntónioThe vertebrate organisms are characterized by being asymmetrically organized in three different axes, it is important to study the onset of these axes. Several pathways are involved in this crucial event, among them is Transforming Growth Factor-β (TGF-β) superfamily which comprises several key molecules as Nodal and Bone Morphogenetic Proteins (BMP). The Anterior Visceral Endoderm (AVE) is a very important structure during mouse embryonic development, where first asymmetries start to show and axes start to be established. Several genes such as mouse cerberus-like, a member of the TGF-β superfamily, and a Nodal and BMP antagonist, are expressed in this tissue and are of major importance for correct development of the embryo. cerl-1 is a critical player in the Nodal signaling pathway, which is of major importance during gastrulation and the onset of axes establishment. Interestingly, the analysis of potential interactions between Cer-l and Nodal co-receptor Cripto, suggested the possibility of a Cripto independent Nodal signaling pathway, in establishing the anterior-posterior (A-P) and dorso-ventral (D-V) axes during embryonic development. In an attempt to further study the AVE a pool of novel genes upregulated in this tissue was discovered by a differential screening. Among these were found shisa and ADTK1. Previous work in Xenopus has shown that Shisa-1 inhibits both FGF and Wnt signaling pathways, by regulating the maturation of their receptors. Downregulation of Shisa-1 leads to defects in anterior structures. In the lab, it was demonstrated that Shisa-2 is involved in the correct development of somites. During this work, it was performed an exhaustive comparative analysis of shisa expression patterns in mouse and chick. Cross-species comparison showed that the expression pattern is conserved in mouse and chick, indicating that the Shisa family genes are typically expressed in tissues known to require the modulation of Wnt and FGF signaling, such as somites, eye and limbs. The largest part of this work consisted of the analysis of ADTK1 role in mouse. A detailed analysis of its expression pattern was performed, indicating several processes in which this gene might be involved in, such as the formation of anterior structures, limb and heart development and neurulation. This hypothesis was consistent with data from Xenopus and chick orthologs, where downregulation of ADTK1 leads to defects in neural tube closure and heart development, respectively. XV In order to evaluate ADTK1 biological function, a targeted inactivation was performed. Although the majority of ADTK1 null mutants presented no visible phenotype, some presented defects in the eye and ear. Skeletal analysis of ADTK1 null mutants demonstrated defects in bone length; these mutants present shorter limbs than their wild-type littermates. Regarding the internal organs, defects in kidney development were detected in all analyzed mutants. ADTK1 mutant kidneys were larger and had a reddish color, comparing to the wild-type littermates. Furthermore, preliminary histological analysis suggests that the kidney medullar region is affected, and that glomerular structures are diminished, when comparing to the wild type. The process of kidney development is a complex one, not yet fully understood. Several signaling pathways, such as Wnts, Shh, BMPs and FGFs, are involved in the process of nephrogenesis. Once again, as it happens with so many genes, ADTK1 null mutants don‟t mimic the defects presented by downregulation in Xenopus and chick orthologs. It is possible that the lack of striking phenotype can be accounted for the fact that, in mammals, there are several genes with redundant activity, preventing, this way, potential anomalies, and overcoming defects that could lead to embryonic development arrest.
- Morphologic and molecular responses of developing rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) to dietary mineralsPublication . Silva, Nadia; Power, DeborahCalcium (Ca) and phosphorus (P) play a critical role in diverse biological processes, and their regulation is essential for organism health. In the present study, the adaptive response to Ca and P dietary availability in trout (Oncorhynchus mykiss) was evaluated taking an integrative approach. The impact of dietary restriction in Ca and P on skeletal ontogeny, morphology and density was assessed. The expression of previously known Pi responsive genes, along with calciotropic hormones STC, CT and extracellular matrix proteins (osteonectin and osteopontin) was evaluated by RT-qPCR. The activity of the ultimobrachial gland and corpuscles of Stannius was determined by morphometry after immunohistochemistry for calcitonin (CT) and stanniocalcin (STC) respectively. P restricted individuals showed decreased whole body P and Ca content throughout the experiment. The restriction of dietary P led to delayed skeletal ontogeny which affected the mineralization level of both endochondral and dermal bones, and was associated with an increase in the incidence of skeletal malformation. Low Ca and increased P in the diet also delayed skeletal development at D11 but this effect was transient. High dietary P caused increased plasma levels of P by D11 and a cumulative mortality rate of 90% by the end of the experiment. These individuals had denser bones and a lower incidence of malformations, possibly due to the effect of “survival of the fittest”. Of the previously identified molecular markers of P deficiency in trout S10011A was found to be significantly downregulated in P deficient trout fry, while INaPiIIb was dowregulated in trout fry on low Ca and high P diets. The calciotropic hormone STC was upregulated in trout fry on low P diets and CT was downregulated in trout fry on high P and low Ca diets. OSN expression was also downregulated in the high P group. The study indicates that modifications in the dietary Ca and P during development significantly modify the ontogeny and density of the skeleton. The availability of Ca and P also led to modification in endocrine factors presumably to ensure maintenance of mineral homeostasis. It seems likely that changes in hormone production may be responsible for changes in transcript abundance of specific transporters/binding proteins of Ca and P although in the present study it was not possible to test this hypothesis.
- Evaluation of pEPI-1 and pEPito expression systems for gene transfer to the retinaPublication . Calado, Sofia de Amaral Melo; Silva, GabrielaO objectivo de estudo do nosso laboratório é o desenvolvimento de vectores não virais para a terapia génica ocular. O principal objectivo da terapia génica é a introdução de material genético no interior das células. Em teoria, o veículo ideal para a terapia génica é aquele que consegue penetrar eficientemente a membrana celular e libertar o material genético, sem desencadear uma resposta imunológica agressiva.
- Estudo do papel de genes interagindo funcionalmente/fisicamente com Cited2 na biologia das células estaminais embrionáriasPublication . M., Trindade; Bragança, José Eduardo MarquesAs células estaminais embrionárias são caracterizadas por possuírem a capacidade de se auto-renovarem indefinidamente em cultura e por possuírem a capacidade de se diferenciarem em qualquer tecido ou célula de um organismo adulto (pluripotência). As funções das células estaminais embrionárias são controladas por factores extrínsecos e intrínsecos, sendo os factores de transcrição Nanog, Oct4 e Sox2 proteínas chaves para manter a pluripotência. No entanto, existem factores de transcrição auxiliares que também participam na regulação destes e de outros genes importantes para a pluripotência, tais como Zic3, Smad2/3, Tbx3, Klf4 por exemplo. Cited2 é um factor de transcrição importante para múltiplos processos do desenvolvimento embrionário de ratinho, cuja sobrexpressão é capaz de manter as células estaminais de ratinho com características de pluripotência na ausência do factor inibitório da leucemia (LIF) necessário para impedir a diferenciação das células estaminais embrionárias de ratinho em cultura. Neste trabalho experimental os principais objectivos foram verificar o efeito do factor Cited2 no controlo da actividade do promotor de Nanog em conjunto com outros factores de transcrição e determinar a influência da sobrexpressão de Cited2 no estado de metilação da lisina 4 da histona H3 (H3K4) nos promotores dos genes Nanog, Oct4 e Tbx3. Os nossos estudos revelaram que o Cited2 possui interacções com vários domínios do promotor de Nanog. Observou-se também que o Cited2 não altera significativamente o estado de metilação H3K4 dos promotores de Nanog e Oct4, contudo parece estar a influenciar negativamente o estado de metilação de Tbx3. Verificou-se ainda que a sobrexpressão de Cited2 provoca um aumento da actividade do promotor de Nanog, em aproximadamente duas vezes. Nas nossas condições, também observamos um efeito cooperativo modesto mas significativo entre Smad2, Zic3 e Cited2 para activar o promotor de Nanog, enquanto a sobrexpressão de Nanog e p53 em presença ou ausência de Cited2 reduzem a actividade deste promotor.
- Synthesis of polymer nanoparticles sensitive to pH for DNA delivery in intracellular environmentPublication . Lopes, Eduardo; Costa, Ana; Silva, GabrielaNos últimos anos, a terapia génica tem sido estudada como uma potencial abordagem para o tratamento de doenças de base genética. Este tipo de abordagem envolve o uso de plasmídeos, oligonucleótidos, ribozimas, entre outros, como um meio de modular a expressão genética e, consequentemente, gerar um efeito terapêutico. A célula apresenta várias barreiras à inserção de material genético no seu interior tais como a membrana celular, o sistema endossomal e a membrana nuclear. Posto isto, é crítico desenvolver métodos de entrega de DNA eficientes para que a terapia génica possa atingir todo o seu potencial. Em terapia génica, inicialmente foram utilizados métodos mecânicos e eléctricos para inserção do DNA no interior das células, recorrendo-se a estratégias como microinjecção, bombardeamento de partículas, pressão e eletroporação. Não obstante a enorme eficiência de transfeção destas técnicas, são contudo invasivas, laboriosas e difíceis de aplicar num cenário clínico. Face a estes constrangimentos, desenvolveram-se outras técnicas de entrega de material genético envolvendo o uso de vectores, dividindo-se estes em duas categorias: vectores de entrega virais e vectores de entrega não virais. Um vector de entrega deve possuir características tais como ser biodegradável, pouco tóxico e imunogénico, poder constituir uma formulação farmacêutica estável e ser altamente eficiente e específico no processo de transfecção. Milhões de anos de evolução tornaram os vírus em agentes infecciosos bastante eficientes, deste modo, vectores de entrega virais compreendem a aplicação de vírus tais como retrovírus, adenovírus, lentivírus, entre outros. A grande vantagem de recorrer a vírus como vectores de entrega de material genético é a elevada eficiência de transfecção resultante. No entanto, o uso de vectores virais pode desencadear resposta imunitária e/ou levar à potencial integração aleatória dos genes terapêuticos no genoma do hospedeiro, com consequências bastante negativas. Deste modo, o foco de atenção tem incidido na aplicação de vectores de entrega não virais numa óptica de contornar as desvantagens apresentadas. Por sua vez, os vectores de entrega não virais podem ser categorizados em sistemas de entrega lipossomais ou poliméricos. Os vectores de entrega lipossomais utilizados em terapia génica são numerosos, podendo ser catiónicos, aniónicos, sensíveis ao pH, camuflados ou imunolipossomas. No geral, a grande vantagem em se recorrer a este tipo de vectores é a baixa imunogenicidade dos lipossomas e a facilidade com que são manipuláveis a nível de formulação, sendo possível produzir lipossomas com características bastante definidas em termos de tamanho, carga de superfície, composição e morfologia. No entanto, apresentam desvantagens como citotoxicidade e pouca estabilidade. Os vectores de entrega poliméricos geralmente envolvem o uso de polímeros catiónicos uma vez que estes são capazes de complexar o DNA carregado negativamente por intermédio de interacções electrostáticas entre as cargas positivas presentes no polímero e os grupos fosfato na presentes na estrutura das moléculas de DNA, formando-se assim complexos denominados de poliplexos. Esta abordagem engloba o uso de polímeros como dendrímeros, PEI, PDMAEMA e quitosano. As vantagens mais importantes apresentadas por esta abordagem são a versatilidade de propriedades físico-químicas e facilidade de manipulação características dos polímeros. Dendrímeros tais como a PAMAM, apresentam vantagens a nível do controlo da sua síntese, sendo possível produzir polímeros bastante monodispersos, o que resulta numa elevada reprodutibilidade na entrega de material genético. Um dos polímeros mais estudados em terapia génica é o PEI. Trata-se de um polímero caracterizado pelo seu enorme potencial catiónico, traduzindo-se em elevadas eficiências de transfecção. A enorme desvantagem deste polímero é a sua elevada toxicidade, sendo que se desenvolveram estratégias de modo a amenizar esta característica. Uma alternativa bastante viável ao PEI é o PDMAEMA. Este polímero catiónico solúvel em água também é capaz de interagir eletrostaticamente com o DNA de modo a formar poliplexos. Vários estudos demonstraram que a eficiência de transfecção deste polímero é proporcional ao seu peso molecular. Este polímero apresentou uma elevada eficiência de transfecção in vitro (cerca de 10%) quando avaliado em células OVCAR-3. Para além dos polímeros sintéticos apresentados, os polímeros naturais como o quitosano são bastante apelativos para aplicações em terapia génica devido às suas baixas toxicidades e biodegradabilidade. Por outro lado, normalmente apresentam eficiências de transfecção mais baixas que os polímeros sintéticos. Tendo em conta o enorme potencial que reside na aplicação de polímeros para entrega de DNA no interior das células, a síntese de polímeros é por isso de uma fulcral importância. Um dos processos mais usados na síntese de polímeros é a polimerização radicalar, sendo que a polimerização via RAFT sobressai de entre as demais técnicas devido à sua versatilidade em termos de condições de reacção e controlo sobre os pesos moleculares dos polímeros sintetizados. Outra característica digna de relevo é a baixa polidispersidade de pesos moleculares de polímeros formados por intermédio de polimerização via RAFT. O objectivo deste trabalho foi avaliar se o PDMAEMA é um bom candidato para ser usado em terapia génica na retina. Para tal, PDMAEMA foi sintetizado por RAFT, com uma previsão inicial de peso molecular de 200 kDa. Posteriormente, o polímero resultante foi avaliado em termos de propriedades físico-químicas e biológicas. A estrutura do polímero foi confirmada por intermédio de espectroscopias de H1 NMR e FTIR, pelo que a síntese, a nível químico, foi um sucesso. De modo a se avaliar a massa molecular do polímero, procedeu-se a uma GPC. Por intermédio desta técnica, verificou-se que o polímero sintetizado apresentava uma massa molecular média de 354 kDa, valor este superior ao esperado. Subsequente caracterização do polímero envolveu a execução de uma titulação potenciométrica, sendo que se verificou que o PDMAEMA tem um pKa de cerca de 7, muito próximo do pH fisiológico. O valor obtido revela que este polímero é potencialmente capaz de manter material genético encapsulado a valores de pH inferiores a 7 (como por exemplo no interior de um endossoma cujo pH ronda os 5) e, por outro lado, libertar o mesmo a um pH igual ou superior ao fisiológico. O PDMAEMA foi avaliado em termos de toxicidade por intermédio de um ensaio de contacto directo entre células e polímero. A toxicidade do material foi então avaliada nas linhas celulares HEK293, ARPE-19 e D407, sendo que as duas últimas são derivadas de células RPE, constituindo um modelo in vitro de células da retina. As viabilidades celulares foram avaliadas por intermédio do ensaio de MTT. Os resultados deste ensaio revelaram que a toxicidade do polímero é não só proporcional à sua concentração mas também ao tempo de duração do ensaio de incubação. Verificou-se também que a toxicidade do PDMAEMA é substancialmente mais acentuada nas linhas celulares RPE relativamente à HEK293. Não obstante este resultado, a concentração do material a usar num ensaio in vivo torna estes valores negligenciáveis. Por intermédio de electroforese em gel de agarose, verificou-se que poliplexos de PDMAEMA/pDNA nas razões N/P de 5, 10 e 20 encapsularam e protegeram o DNA de degradação por parte de DNases. Um ensaio de libertação efectuado em poliplexos na razão N/P de 10 revelou que estes começam a libertar o material genético após 72 h, a pH fisiológico. Poliplexos de PDMAEMA/pDNA a várias razões N/P (5, 10, 20), foram caracterizados em termos de tamanho e magnitude de carga de superfície por intermédio de medições de DLS e potencial zeta, respectivamente. Estas medições revelaram poliplexos com tamanho médio de 213 nm e índices de polidispersidade aceitáveis. O tamanho das partículas verificou-se ser inversamente proporcional à razão N/P. No que respeita aos potenciais zeta, a magnitude de carga média na superfície dos poliplexos foi de 18 mV. Os potenciais zeta obtidos foram não só positivos em todos os casos mas também directamente proporcionais à razão N/P, o que nos indica que poliplexos de PDMAEMA/pDNA interagem electrostaticamente com as cargas negativas à superfície das membranas biológicas, potencialmente facilitando a sua internalização. A eficiência de transfecção de poliplexos nas razões N/P de 5, 10 e 20 foram avaliadas pela expressão do gene repórter GFP nas três linhas celulares previamente estudadas para avaliação de toxicidade. A avaliação do número de células GFP-positivas foi efectuada por intermédio de microscopia de fluorescência. Verificou-se que todas as linhas celulares foram eficientemente transfectadas pelos poliplexos, pese embora a eficiência de transfecção ter sido inferior nas linhas celulares RPE. Ensaios preliminares para a avaliação da eficiência de transfecção em células ARPE-19, por intermédio de citometria de fluxo, aparentemente não indicaram a real eficiência de transfecção deste polímero. Tomando em linha de conta os resultados como um todo, é seguro afirmar que o PDMAEMA é um candidato viável para terapia génica na retina.