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Browsing FCB1-Teses by Field of Science and Technology (FOS) "Engenharia e Tecnologia::Outras Engenharias e Tecnologias"
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- Characterization of bone pathologies in the ins2+/akita mouse, a new model for diabetes insulindependent: contribution for a better understanding of the disease in humansPublication . Carvalho, Filipe Ricardo Pires de; Cancela, Leonor; Gavaia, Paulo J.In the past 30 years developed and developing countries faced significant lifestyle changes that made the incidence of diabetes mellitus to reach pandemic proportion worldwide. This increase, seen in both types of the disease, made diabetes mellitus one of the leading causes of morbidity and mortality of our times. Bone is one t of several organs that are affected by diabetes mellitus, being morbidity caused by bone fractures highly correlated to diabetic bone. Alterations in the constituents of bone, microarchitecture changes and bone loss have been pointed as the main reasons for its fragility. This work aimed to contribute to identify the molecular players or the functional changes affecting bone and caused by diabetes mellitus. In chapter 2, using as animal model of type 1 diabetes mellitus the Ins2+/akita mouse, we identified bone growth retardation related to growth plate impairment. These changes were associated to reduced expression of Igf1 and increased expression of cartilage degradation enzymes like Adams-5. We also identified severe microarchitecture changes caused by reduced bone formation and resorption that could be explained by leptin deficiency and/or decreased insulin signaling. In chapter 3, we concluded that paricalcitol (vitamin D analog) and cinacalcet (calcimimetic), two drugs used for the treatment of secondary hyperthyroidism, have beneficial effects in fin regeneration and mineralization in a zebrafish model of diabetes. These results could be explained by the downregulation of pthr suggesting reduced signaling of parathyroid hormone, that is a potent activator of bone remodeling, and increased expression of runx2, indicating increased osteoblast differentiation. Increased expression of the two zebrafish insulin genes, insa and insb, could be observed, suggesting that both drugs promote an increase in insulin signaling. In chapter 4, we suggest that in humans, the insulin paralog gene, INS-IGF2, does not have a redundant function with the insulin gene, in contrast with what is seen in mice and probably in zebrafish. We could also conclude that extrapancreatic expression of insulin is present in human, mouse and zebrafish. In humans this expression results mainly from expression of the ancestral gene while in mice and zebrafish it is due to expression of the insulin paralogues.
- Characterization of the behavioural phenotype of calpain-knockout micePublication . Silva, Joana Andreia Joaquim da; Araújo, InêsAdult neurogenesis consists of the production of new neurons in specific brain regions, or neurogenic niches. The most relevant niches in rodents are the subventricular zone lining the lateral ventricles and the dentate gyrus of the hippocampus. Neurogenesis has been shown to influence cognitive function dependent on these regions. Evidence from the literature suggests that calpains are able to influence neurogenesis. However, little information is available regarding their participation in neurological functions. We have evaluated the involvement of calpains in cognitive and emotional behaviour by evaluating these functions in mice genetically modified to lack calpain 1, calpain 2, or both calpains. In this work, 12 week old calpain knockout mice for calpain 1, calpain 2, both, or wild type (WT) littermates were used. The mice were tested in the open field, object recognition, Morris water maze, contextual and cued fear conditioning, passive avoidance, elevated plus maze and forced swimming tests, to evaluate neurological function. Results from the elevated plus maze show that calpain2 knockout mice and double knockout mice present an anxious phenotype comparing with WT mice, suggesting that calpain 2, but not calpain 1, is involved in anxiety. Memory, learning, locomotor activity and exploratory behaviour as well as helplessness were similar in calpain knockout and WT mice. Neurogenesis in calpain knockout mice was also similar to WT mice. Overall, our work shows that calpain 2 is involved in anxiety and a clear phenotype was identified in calpain knockout mice regarding their involvement in memory and learning, which is agreement with previously published data using mice that lack the small regulatory subunit of calpains.
- Definição dos mecanismos de polaridade celular durante a citocinesePublication . Silva, Frederica Gil Figueiredo Leitão; Florindo, Cláudia; Tavares, ÁlvaroA conclusão do processo da citocinese é o evento final da divisão celular. De forma a garantir a estabilidade genética dos organismos a citocinese não pode ocorrer antes que os cromossomas sejam fielmente segregados. Falhas neste processo são uma importante causa de instabilidade genética, ou seja, quando desregulado este processo poderá conduzir a anormalidades em organismos multicelulares, como o cancro. Durante a citocinese há a constrição do anel de actmiosina, seguindo-se a formação da ponte intercelular, na qual no meio se encontra o midbody. Este é constituído por várias proteínas que são necessárias para o início da abscisão (ex: hsMOB4A e hsMOB4B, γ-tubulina, centriolina, etc). Trabalhos anteriores do nosso grupo mostraram que as proteínas hsMOB4A e hsMOB4B são essenciais para a execução da abscisão e que quando depletadas aumentam a mobilidade celular. Muitas proteínas que se localizam no midbody, encontram-se também noutras estruturas (ex: centrossomas). Esta diversidade de localizações e funções, torna a dissecação do mecanismo citocinético complicado, sendo de difícil análise a função de cada proteína associada a uma localização celular, apenas através da técnica de RNAi. Uma técnica que permite a inactivação temporal e local é a Chromophore Assited Laser Inactivation (CALI). A base desta técnica é a inactivação local da proteína de interesse devido a geração de espécies reactivas de oxigénio (ROS) após a iluminação com um laser. Neste trabalho, foram desenvolvidas ferramentas para a realização de ensaios de CALI. Criaram-se linhas estáveis a expressar β-tubulina-SNAP-tag e γ-tubulina-SNAP-tag para otimização dos ensaios de CALI e, também, para analisar qual a função destas proteínas na abscisão. Para ensaios de CALI em conjunto com a técnica de RNAi (para deplecção da hsMOB4A e hsMOB4B endógenas) nas proteínas hsMOB4A e hsMOB4B, foram concebidos e caracterizados clones hsMOB4A e hsMOB4B resistentes ao RNAi, com o objectivo da geração de duas linhas estáveis, SNAP-tag-hsMOB4A e SNAP-tag-hsMOB4B resistentes ao RNAi, de modo a perceber qual a localização necessária destas proteínas para que ocorra o processo de abscisão. Todas estas ferramentas desenvolvidas ao longo deste trabalho, permitirão realizar ensaios de CALI nas proteínas de interesse e compreender qual a sua localização para que ocorra o evento final da citocinese, a abscisão.
- Defining the role of NatC dependent N-terminal acetylation in Drosophila fertilityPublication . Faustino, Alexandra Ferreira; Martinho, Rui GonçaloAcetilação no N-terminal é uma das modificações co-traducionais mais comuns em células eucariotas. Esta reacção química é catalizada por uma família altamente conservada de N-acetiltransferases (NatA - NatF), que possuem subunidades e especificidades para o substrato distintas. Apesar de a acetilação no N-terminal ter sido descrita há mais de 50 anos atrás, a sua função biológica continua pouco conhecida. Publicações recentes têm demonstrado que poderá ter uma papel na estabilidade, função, localização celular e secreção de proteínas. Ao nível da regulação do tráfego de proteínas, foi observado em levedura que a acetilação no N-terminal, mediada pelo complexo NatA, inibe a translocação até ao retículo endoplasmático. Pelo contrário, foi demonstrado que a acetilação no N-terminal mediada pelo complexo NatC é importante para que haja a interacção das GTPases Arl3p e Grh1p com a membrana do Golgi, de Arl8a/b com a membrana do lisosoma e da proteína Trm1p-II com a membrana nuclear interna. Contudo, NatC não é um determinante geral da localização celular de proteínas, regulando apenas um grupo específico de substratos. A função da acetilação no N-terminal durante o desenvolvimento de um organismo multicelular é pouco conhecida. Trabalhos prévios sugerem que o complexo NatC poderá ter um papel na regulação do crescimento e desenvolvimento de uma vasta gama de organismos. O objectivo desta tese foi identificar e caracterizar fenotipicamente o complexo NatC em Drosophila melanogaster. Após identificação da subunidade catalítica (dnaa30), moscas mutantes por deleção foram obtidas (dnaa30Δ74). Nós observámos que uma deleção no gene dnaa30 afecta a fertilidade de Drosophila: a maioria dos machos revelou ser estéril e uma redução da fertilidade das fêmeas foi observada. A contribuição maternal de dnaa30Δ74 durante a oogénese leva a uma redução da fertilidade das fêmeas devido a problemas de divisão nuclear nos embriões. A contribuição maternal da versão selvagem de dnaa30 é no entanto essencial para a viabilidade dos machos mutantes (mutantes zigóticos). O efeito observado na fertilidade é um fenótipo específico de dnaa30 pois a expressão ubíqua de dNaa30-Myc em machos mutantes leva à recuperação da fertilidade. Observámos que a maioria da descendência proveniente do cruzamento de machos mutantes com virgens selvagens parecem ser ovos não fertilizados. Contudo a esterilidade dos machos mutantes não é resultante de problemas na linha germinal, uma vez que os machos mutantes revelaram ter uma espermatogénese e uma motilidade de esperma equivalente ao controlo. Assim, colocámos a hipótese da esterilidade ser devida a problemas de comportamento (ritual de acasalamento). Apesar de preliminares, os nossos resultados sugerem que machos mutantes para dnaa30 possuem problemas ao nível do ritual de acalamento. Nenhum dos machos mutantes avaliados revelaram ritual de acasalemto. Estes resultados sugerem que dnaa30 poderá ter uma função neuronal. A função neuronal de dnaa30 foi confirmada e em parte contribui para o fenótipo de esterilidade observado, pois a expressão de dNaa30-Myc nos neurónios de machos mutantes leva à recuperação da fertilidade. O papel de dnaa30 noutros tecidos não pode ser descartada, uma vez que a recuperação da fertilidade foi menor que a observada com a expressão ubíqua de dNaa30-Myc. Os machos mutantes para dnaa30 revelaram também uma redução na longevidade e na locomoção. Estes fenótipos são independentes da esterilidade observada. Assim sendo, a esterilidade resultante de uma deleção no gene dnaa30 parece ser um fenótipo específico e não uma consequência da redução de mobilidade e longevidade. Para explicar os fenótipos observados nos machos mutantes para dnaa30, propomos o seguinte modelo: a acetilação de Gie (Drosophila Arl8) no N-terminal, mediada por dnaa30, é uma mecanismo que regula a actividade dessa GTPase em diversos processos celulares dependentes de microtúbulos: transporte de proteínas pre-sinápticas, segregação de cromossomas... Em resumo, o trabalho desta tese revela que naa30 em Drosophila tem um papel neuronal que afecta o ritual de acasalamento e a fertilidade. Tanto quanto nós estamos cientes, esta é a primeira vez que uma associação entre acetilação N-terminal e comportamento é observada num organismo multicelular.
- Development of Locust Bean Gum Nanoparticles for protein deliveryPublication . Raimundo, Pedro; Grenha, AnaO interesse pela goma de alfarroba tem vindo a crescer ao longo dos últimos tempos. Inicialmente na região do Algarve utilizava-se a goma de alfarroba para alimentar animais de pecuária, contudo, por conter um polissacárido com propriedades importantes em variados setores económicos, passou a ser utilizada na indústria de transformação alimentar como espessante e na indústria farmacêutica como agente gelificante. Além das aplicações referidas anteriormente, a goma de alfarroba pode ser utilizada para muitas mais finalidades. Por se tratar de um polissacárido biodegradável e potencialmente não tóxico, revela-se interessante explorar as suas capacidades como material formador de matriz de sistemas de administração de fármacos e, nomeadamente, de proteínas, por vias mucosas. São vários os sistemas de administração, mas as nanopartículas têm chamado particularmente a atenção no âmbito da administração de proteínas. Para que uma administração por vias mucosas seja efetiva, os sistemas nanoparticulados devem ter um tamanho entre 50 e 500 nm (para maximizar a sua interação), e um potencial zeta positivo (para poderem interagir com o ácido siálico que tem carga negativa e se encontra na superfície das mucosas). Além disso, outras características são requeridas para que se possam utilizar estes sistemas para administração proteica, nomeadamente uma eficácia de encapsulação razoável e ausência de toxicidade. Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento de nanopartículas de goma de alfarroba, para entrega de proteínas com fins sistémicos, através das vias mucosas. De modo a ir de encontro ao objetivo, o desenvolvimento do sistema nanoparticulado de goma de alfarroba proposto teve por base a utilização de um método de complexação polieletrolítica, segundo o qual as nanopartículas se formam por interação eletrostática entre grupos químicos dos polímeros que apresentam cargas opostas. Dada a neutralidade deste polissacárido, um trabalho anterior do grupo de investigação consistiu numa síntese química para produção de derivados carregados de goma de alfarroba. Foi assim produzido um derivado aminado e um derivado sulfatado, os quais exibem cargas opostas, permitindo a formação das nanopartículas por complexação polieletrolítica. As nanopartículas resultantes foram caraterizadas relativamente ao seu tamanho, índice de polidispersão, potencial zeta, rendimento de produção, eficácia de encapsulação, bem como quanto ao perfil de citotoxicidade no âmbito de administração por vias mucosas. Para preparar as nanopartículas foram utilizados três rácios de massa de goma de alfarroba aminada (A-LBG) e goma de alfarroba sulfatada (S-LBG), respetivamente 2/1, 1/1 e 1/2. Depois de obter as duas soluções respetivas, o S-LBG é adicionado ao A-LBG, sob agitação magnética moderada, em concentrações diferentes de modo a ter as três razões de massa. A formação das nanopartículas ocorre de forma imediata, mas as suspensões permanecem em agitação durante 10 minutos. Imediatamente após a mistura dos dois polímeros, é possível observar o efeito de Tyndall, que evidencia a formação de nanopartículas. As suspensões destas são centrifugadas a 16000xg, a 15 ºC durante 30 minutos, sobre uma camada de 10 μL de glicerol, a qual visa facilitar a ressuspensão das nanopartículas. Após a centrifugação, o sobrenadante é descartado e as nanopartículas são ressuspendidas em 100 μL de água para utilização nos ensaios subsequentes. A formulação A-LBG/S-LBG = 2/1 apresentou um diâmetro de aproximadamente 560 nm, um índice de polidispersão de 0,432 e um potencial zeta de +43,5 mV. A formulação A-LBG/S-LBG = 1/2 apresentou um diâmetro de aproximadamente 359 nm, um índice de polidispersão de 0,381 e um potencial zeta de -49,7 mV. A formulação A-LBG/S-LBG = 1/1 precipitou no momento em que o S-LBG foi adicionado ao A-LBG e, como tal, esta formulação foi abandonada. Atendendo a estes valores, em termos de diâmetro, a formulação 2/1 apresenta um diâmetro acima do que seria ideal e a formulação 1/2 apresenta um diâmetro entre os valores pretendidos. Relativamente à polidispersão, ambas as formulações apresentam valores abaixo do limite máximo aceite (0,5) no entanto estão acima do valor ideal (0,2). É no entanto importante assinalar que para nanopartículas produzidas com polímeros naturais é muito difícil obter índices de polidispersão abaixo de 0,2. Analisando os valores de potencial zeta, a formulação 2/1 apresenta um potencial positivo, que é mais coincidente com os objetivos da administração transmucosa, e a formulação 1/2 apresenta um potencial negativo. Os valores de potencial observados estão de acordo com a carga exibida pelo polímero predominante em cada formulação. O potencial negativo, apesar de não ser ideal para o objetivo de administração transmucosal, não é desfavorável, porque pode ser utilizado para outro tipo de terapias. Para o cálculo do rendimento de produção, a preparação das nanopartículas é feita como descrito anteriormente, com exceção do facto de não se utilizar glicerol, nem haver ressuspensão. Após a centrifugação o sobrenadante é descartado e o sedimento de nanopartículas é sujeito a congelação e posterior liofilização. A formulação 2/1 teve um rendimento de produção de aproximadamente 17% e a formulação 1/2 de 30%, os quais são considerados baixos. Para testar a capacidade das nanopartículas como transportadores de proteínas, a insulina foi selecionada como proteína modelo. Dado o seu ponto isoelétrico (pI), que é de 5.3, a proteína não dissolve em água. Para a sua solubilização usam-se o NaOH ou o HCl, ambos à concentração de 0,01 M, ficando a proteína com uma carga negativa ou positiva, respetivamente. Na abordagem inicial, tentou-se fazer a associação de uma quantidade de insulina equivalente a 30% do total da massa de polímeros utilizados na preparação das nanopartículas, mas não houve sucesso, já que se verificava precipitação. Após otimização do processo, assumiu-se a quantidade de insulina correspondente a 10% da massa do polímero que contribui com maior massa na preparação de cada formulação. Como a formulação A-LBG/S-LBG = 2/1 tinha mais quantidade de polímero positivo (conferindo um potencial zeta positivo), é maior o número de grupos carregados positivamente que estão disponíveis para interação com outras moléculas, em comparação com os grupos carregados negativamente. Assim, para esta formulação a insulina foi dissolvida em NaOH para assumir uma carga negativa e ter desta forma maiores probabilidades de interação e, consequentemente, de associação às nanopartículas. Após solubilização, a insulina foi adicionada à S-LBG, que tem igualmente carga negativa, evitando-se a interação eletrostática entre ambos os polímeros. Esta solução mista foi posteriormente adicionada à solução de A-LBG para formação das nanopartículas, havendo uma competição entre a insulina e a S-LBG pelos grupos carregados positivamente da A-LBG. Ao contrário, a formulação A-LBG/S-LBG = 1/2 tinha mais polímero de S-LBG, que tem carga negativa, o que proporciona em princípio maior capacidade de interação com grupos carregados positivamente. Neste caso, então, a estratégia consistiu em atribuir à insulina um predomínio de cargas positivas no momento da preparação das nanopartículas. Para isso, a proteína foi dissolvida em HCl e adicionada ao A-LBG, antes da adição desta mistura à S-LBG. A eficácia de encapsulação de insulina observada foi de 15% para ambas as formulações, um valor considerado reduzido. Com vista a aumentar a eficácia de encapsulação, foi feita uma otimização que teve por base a hipótese de alterar o pH do meio da insulina de forma a ficar próximo do seu ponto isoelétrico. A literatura disponibiliza pelo menos um trabalho que mostra que há uma maior adsorção das proteínas aos polímeros quando estas se encontram em meios com pH perto do seu ponto isoelétrico. No valor de pH equivalente ao ponto isoelétrico, a insulina ficará com um equilíbrio de cargas positivas e negativas e deixará livres as cargas dos polímeros, para interagirem entre si, maximizando a sua interação e a insulina ficará adsorvida aos polímeros na matriz das nanopartículas formadas. De forma a testar a hipótese anterior, para a formulação 2/1, a solução mãe de insulina foi preparada em NaOH, mas na preparação das diluições de A-LBG e S-LBG a partir das correspondentes soluções mãe, a água utilizada nas diluições foi substituída por tampão citrato (pH 5,0) por ter um pH próximo do ponto isoelétrico da insulina, fazendo com que esta exibisse um equilíbrio de cargas negativas e positivas após solubilização. Para a formulação 1/2 a insulina foi dissolvida em HCl e depois foi inicialmente realizado o mesmo procedimento com o tampão citrato, como para a formulação 2/1, mas ocorria precipitação. A otimização para a formulação 1/2 foi então realizada substituindo a água da solução S-LBG por uma solução de HCl a 0,1 M. As otimizações que foram operadas acolheram sucesso, tendo conduzido a um aumento das eficácias de encapsulação, na formulação 2/1 de 15% para 22% e na formulação 1/2 de 15% para 96%. As nanopartículas carregadas com insulina foram caraterizadas quanto às propriedades físico-químicas. Para a formulação 2/1 registou-se um diâmetro de 740 nm (PDI de 0,389) e um potencial zeta de +22,8 mV. Para a formulação 1/2 o diâmetro foi de 400 nm (PDI de 0,404) e o potencial zeta -33,6 mV. No entanto, na formulação 1/2 observaram-se alguns agregados de difícil ressuspensão, mesmo após alteração da quantidade de glicerol utilizada. Dado o objetivo de aplicação das nanopartículas desenvolvidas na administração por vias mucosas, considerou-se relevante avaliar a toxicidade das formulações. Realizou-se assim um ensaio de citotoxicidade em duas linhas celulares epiteliais, Caco-2 e A549. A primeira linha representa o epitélio intestinal, enquanto a segunda representa o epitélio pulmonar e, mais especificamente, alveolar. As concentrações testadas foram de 0,1 mg/mL, 0,5 mg/mL e 1 mg/mL para ambas as formulações. Os tempos de incubação das células com as nanopartículas foram de 3 horas e 24 horas para ambas as formulações, e linhas celulares, bem como para todas as concentrações. Em ambas as linhas celulares a viabilidade ficou acima de 70% para as duas formulações, indicando que as nanopartículas possuem baixa citotoxicidade. Em conclusão, os derivados de LBG sulfatado e aminado permitem a formulação de nanopartículas com capacidade para associar insulina. No entanto, a formulação 2/1 apresenta um tamanho inadequado para o objetivo de administração por vias mucosas, além de baixo rendimento de produção e eficácia de encapsulação. A formulação 1/2 apresenta um tamanho aceitável para o objetivo descrito, bem como uma eficácia de encapsulação muito significativa. No entanto, o rendimento da formulação é algo baixo e o seu potencial zeta negativo, possivelmente registando uma menor propensão para interação com a superfície epitelial em comparação com uma formulação de carga positiva. Este tipo de nanopartículas, pode ser utilizado em superfícies com carga positiva que requeiram nanopartículas com potencial zeta negativo, ou para encapsular moléculas de carga positiva, maximizando a sua interação.
- Differentiation of human pluripotent stem cells to the neuronal dopaminergic fatePublication . Martins, Ana Rita Ferreira; Tiscornia, GustavoA doença de Gaucher foi descrita pela primeira vez por Phillipe Gaucher em 1882. É uma doença rara e hereditária que se deve à deficiência da enzima glucocerebrosidade. Esta deficiência leva ao armazenamento excessivo de glucosilceramida no fígado, baço, osso e medula óssea. Além disso, pacientes com doença de Gaucher podem apresentar, também, manifestações neurológicas. A apresentação clínica desta doença envolve, então, um fenótipo sistémico e um fenótipo neurológico. Ao longo dos anos, tem vindo a ser descrito três tipos principais da doença de Gaucher, com base na presença (tipo 2 e tipo 3) ou ausência (tipo 1) e da severidade das características neurológicas (Elstein, Abrahamov et al. 2001). O tipo 1 é o mais comum; é particularmente prevalente entre os judeus de Ashkenazi e é caracterizado como a variante não-neurpática. O tipo 2 e 3 são caracterizados como variantes neuropáticas, porque, para além da apresentação sistémica, o sistema nervoso central é afectado e são distinguidos pela idade de início e progressão da doença. (Grabowski, Barnes et al. 2011). A marca do tipo 2 é a grave neurodegeneração. O tipo 3 tem manifestações neurológicas mais atenuadas. (Grabowski, Barnes et al. 2.011, B. e N. 2013) A descoberta neuropatológica mais consistente nas formas neuropáticas da doença de Gaucher é o acúmulo periadventicial de glucosilceramida juntamente com neuroinflamação e perda neuronal. Actualmente, tratamentos para doença de Gaucher, clinicamente usados para o tipo sistémico da doença, incluem a terapia de reposição enzimática e terapia de redução de substrato. A terapia de reposição enzimática envolve perfusão regular de glucocerebrosidase recombinante para a corrente sanguínea dos pacientes. A enzima recombinante é sujeita a endocitose por macrófagos e a função lisossómica é parcialmente restabelecida (& B. N., 2013; Elstein, Abrahamov, Hadas-Halpern, & Zimran, 2001). A terapia de resução de susbstrato envolve a administração oral de um inibidor de glucosilceramida sintetase, por conseguinte, impedindo a síntese do substrato. Significativamente, não existem actualmente tratamentos disponíveis para os aspectos neurológicos da GD, sendo portanto, necessário a procura por novas abordagens. Neurónios de pacientes com este distúrbio são difíceis de encontrar; por conseguinte, são necessárias fontes alternativas para o estudo dos mecanismos patogénicos básicos e o desenvolvimento de terapias. Uma vez que a nossa abordagem é diferenciar células pluripotentes para os neurónios, inicialmente, tentou-se estabelecer um protocolo prático, reprodutível e eficiente para a diferenciação de células estaminais embrionárias humanas em neurónios dopaminérgicos. As células estaminais embrionárias humanas têm a capacidade de se diferenciar nas três camadas germinativas (ectoderme, mesoderme e endoderme) tanto in vitro como in vivo. (Reubinoff, Pera, Fong, Trounson, & Bongso, 2000; Thomson, 1998) A pluripotência in vitro é muitas vezes demonstrada pela capacidade para formar corpos embrióides, que consistem numa massa multicelular, exibindo células das três camadas germinativas. A pluripotência in vivo pode ser confirmada pela capacidade para formar teratomas, após injecção de células num animal hospedeiro, normalmente esse animal é caracterizado por imunodeficiência combinada grave (SCID). (Heins et al., 2004; Reubinoff et al., 2000) Realizámos vários protocolos com diferentes abordagens: 1) sobre-expressão de fatores de transcrição específicos, 2) co-cultura com células PA6 e 3) formação de corpos embrióides. Além disso, foram testados diferentes parâmetros, incluindo diversos substratos (gelatina, matrigel, fibroblastos e células estromais), densidades celulares, multiplicidade de infecção e meios de indução neuronal. No final de algumas experiências realizadas foi possível observar células diferenciadas, incluindo neurónios maduros e estas células foram analisadas pela técnica de imunofluorescência para identificar marcadores neuronais - β-tubulina III (TUJ1) e tirosina hidroxilase (TH). Posteriormente, efectuou-se uma tentativa de purificar neurónios maduros por citometria de fluxo. Ao adaptar este protocolo para células estaminais pluripotentes induzidas derivadas de fibroblastos de pacientes com a doença de Gaucher, podemos obter neurónios com mutações específicas da doneça, que pode proporcionar novas oportunidades para a pesquisa básica da mesma, e no desenvolvimento de novos compostos terapêuticos.
- Enhancement of non-viral transfection efficiency with nuclear localization signal peptidesPublication . Morais, Joana Silva Jorge Belo; Silva, Gabriela; Oliveira, Ana VanessaA terapia génica envolve a transferência de material genético terapêutico para células alvo, pela introdução de genes funcionais que substituam ou complementem aqueles que se encontram defeituosos, com o objectivo de tratar ou prevenir uma ampla gama de doenças, hereditárias ou adquiridas. No entanto, para o seu sucesso é necessário um sistema de entrega de material genético eficiente, capaz de proteger o DNA da degradação por nucleases e com o mínimo de toxicidade e imunogeneicidade que permita uma expressão genética estável e duradoura. Durante os últimos anos, têm sido desenvolvidos uma ampla gama de vectores, que têm sido divididos e caracterizados como vectores virais e não virais. Os vectores virais apresentam maior eficiência na transferência de material genético, tanto in vitro como in vivo, no entanto apresentam algumas limitações como a reduzida capacidade de empacotamento genético e o facto de conduzirem a respostas inflamatórias/imunológicas indesejáveis que consequentemente limitam administrações subsequentes. Por sua vez, os vectores não virais apresentam algumas vantagens sobre os vectores virais, nomeadamente, um perfil imunológico mais seguro, uma produção mais fácil, uma maior capacidade de empacotamento genético e a sua reduzida toxicidade. Contudo, o uso de vectores não virais é limitado devido às suas eficiências de transfecção relativamente baixas, marcadas pela baixa translocação nuclear, e consequentemente reduzida expressão genética. Vários esforços têm sido realizados no sentido de ultrapassar a barreira nuclear, um dos maiores passos limitantes no desenvolvimento de sistemas de entrega genética não virais eficazes. Uma das estratégias passa pela incorporação de sinais de localização nuclear em complexos poliméricos, uma vez que estes péptidos catiónicos ao serem reconhecidos pelas importinas permitem um transporte genético eficaz para o núcleo através dos complexos de poros nucleares, aumentando assim a entrega nuclear do DNA, e por consequente, a sua expressão genética. Neste contexto, o objectivo deste trabalho foi a caracterização e optimização de vectores não virais, baseados em polímeros como o quitosano e o ácido hialurónico, que foram escolhidos devido às suas notórias propriedades de biocompatibilidade, biodegradação e ausência de toxicidade. Péptidos baseados em sinais de localização nuclear endógenos, pertencentes á família dos IGFBP, derivados nomeadamente do IGFBP-3 e IGFBP-5, foram avaliados com o intuito de melhorar a translocação nuclear sem comprometer o perfil imunológico bastante baixo dos vectores não-virais. Várias estratégias foram testadas para avaliar a eficiência de transfecção e a expressão genética mediada por poliplexos de quitosano e ácido hialurónico em células HEK293T: nomeadamente a co-administração, a co-complexação e a ligação covalente dos péptidos IGFBP aos poliplexos de quitosano. Os nossos resultados mostraram que as nossas formulações, com ou sem sulfato de sódio, péptidos IGFBP ou ácido hialurónico, e independentemente da estratégia usada, originaram poliplexos com um intervalo de tamanhos entre 250 nm e 750 nm e carga de superfície positiva, caracterizados através de medições no Zetasizer. Os nossos poliplexos foram ainda capazes de complexar o DNA de forma eficaz, conforme analisado através de ensaios de electroforese em gel de agarose. Posteriormente à caracterização dos poliplexos, os péptidos IGFBP foram ainda avaliados quanto á sua citotoxicidade em dois períodos de incubação, 24 horas e 72 horas. Os ensaios de viabilidade celular não mostraram qualquer citotoxicidade para ambos os péptidos IGFBP para as várias concentrações testadas nos dois períodos de tempo testados. Após estes resultados, e uma vez que os poliplexos apresentaram características desejáveis quanto ao seu tamanho, carga de superfície e complexação eficiente do DNA, estes foram avaliados quanto à sua eficácia através de ensaios de transfecção in vitro, analisados posteriormente por microscopia de fluorescência e citometria de fluxo. A eficiência de transfecção revelou-se ser dependente da concentração dos péptidos IGFBP e variar consoante o método de entrega utilizado. Nos ensaios de transfecção, utilizando o método de co-administração dos poliplexos com os péptidos IGFBP, nenhum aumento na eficiência de transfecção foi observado. Nos métodos em que estratégias como a co-complexação e a ligação covalente dos péptidos IGFBP aos poliplexos de quitosano foram usadas, um aumento significativo da eficiência de transfecção foi conseguido, no entanto, apenas para os poliplexos associados ao IGFBP-3. Uma possível explicação para estes resultados é o facto de as acessibilidades e/ou afinidades para com as subunidades das importinas diferirem entre os péptidos IGFBP-3 e IGFBP-5, o que consequentemente, poderá levar a níveis de translocação diferentes entre os péptidos, no entanto, ainda não é claro qual o mecanismo. Foi ainda possível verificar que combinando polímeros como o quitosano e o ácido hialurónico, que os poliplexos resultantes renderam um aumento significativo da eficiência de transfecção para ambos os péptidos, IGFBP-3 e IGFBP-5, o que poderá ser explicado por uma possível modificação no enrolamento das cadeias do quitosano aquando da adição do ácido hialurónico. Na sua globalidade os resultados obtidos demonstraram que, apesar de ser ainda necessário uma optimização da eficiência de transfecção, poliplexos co-complexados com péptidos IGFBP são de facto bons candidatos a sistemas de entrega genética não virais. Os poliplexos com dois polímeros combinados, quitosano e ácido hialurónico, foram os que revelaram maiores eficiências de transfecção, para ambos os péptidos, IGFBP-3 e IGFBP-5. Futuramente, seria interessante não só expandir a gama de concentrações de péptidos IGFBP testadas como também o tipo de linhas celulares, compreendendo ainda uma optimização das formulações dos poliplexos.
- Epigenetics and alternative splicingPublication . Silva, Soraia Vanessa Guerreiro da; Carmo-Fonseca, Maria; Custódio, Noélia; Maia, Ana TeresaEpigenética é a área da genética que se foca no estudo das alterações biológicas da célula que não envolvem alterações na sequência de nucleótidos do DNA. Um dos componentes da epigenética que tem vindo a ganhar interesse na comunidade científica são os RNAs longos não codificantes (do inglês long noncoding RNAs - lncRNAs) que são transcritos que contém mais de 200 nucleótidos. Estes não possuem quadros de leitura abertos (do inglês open reading frames – ORFs) e desempenham papéis biológicos importantes em diferenciação celular, pluripotência, regulação da transcrição, processamento e tradução de moléculas de RNAs. Têm sido também muito associados ao desenvolvimento de cancro, nomeadamente, na progressão tumoral e desenvolvimento de metáteses. Várias classes de lncRNAs têm sido descritas tendo em conta, maioritariamente, a localização destes transcritos no genoma em relação a transcritos com potencial codificante, os RNAs mensageiros (mRNAs). Uma classe de lncRNAs com interesse neste projecto é a dos transcritos anti-direccionais naturais (do inglês natural antisense transcripts – NAT). Estes transcritos têm a particularidade de serem codificados na cadeia anti-direccional de genes que codificam mRNAs, podendo haver sobreposição parcial com a região promotora ou com intrões. Pensa-se que poderão estar implicados na regulação da transcrição dos genes codificantes de mRNA ou na regulação da remoção dos intrões (splicing). O presente trabalho é parte de um projecto que tem como objectivo principal investigar a biologia dos lncRNAs no contexto do desenvolvimento de leucemia. Embora já exista evidências recentes que destacam a importância de lncRNAs na regulação da expressão genética, pouco se sabe sobre o seu papel na diferenciação das células T e na transformação leucémica. O objectivo final do projecto em si, é encontrar possíveis alvos para terapias direccionadas a moléculas de RNA em células cancerígenas de Leucemia Linfoblástica Aguda de células T (do inglês T-cell Acute Lymphoblastic Leukaemia - T-ALL). A metodologia proposta neste projecto combina técnicas de alta resolução de epigenómica, transcriptómica e biologia molecular com abordagens para monitorizar a síntese, tempos de semi-vida e localização sub-celular de lncRNAs. A análise está focada em precursores de células T primárias purificadas a partir de tumores do timo de ratinho e em modelos celulares de T-ALL de ratinho. O factor que diferencia e dá o carácter leucémico a estas células é a sobreexpressão do oncogene TLX3 que é considerando um dos genes mais mutados neste tipo de leucemias. No entanto, estudos anteriores mostraram que, por si só, esta sobreexpressão do oncogene não é suficiente para induzir a T-ALL, deste modo, poderão existir outros factores, tais como lncRNA, que estejam envolvidos no desenvolvimento da T-ALL. No âmbito deste estudo, foi seleccionado a partir da literatura uma lista de lncRNAs que são expressos em células T e podem ser relevantes no contexto da leucemia. Para monitorizar o tempo de semi-vida de lncRNAs realizou-se marcação do RNA nascente nas células com um pulso de incorporação (do inglês, pulse labelling) do análogo do uracilo, 4-thioridine (4sU), que é incorporado em todo o RNA sintetizado na célula durante esse pulso de marcação. Segue-se a extracção de todo o RNA da célula e purificação dos RNAs nascente marcados com 4sU, e dos pré-existentes e dos não marcados. A quantificação por RT-qPCR dos lncRNAs de interesse nas diferentes populações de RNA permite o cálculo da semi-vida desses lncRNA. Os resultados obtidos neste trabalho corroboram os dados já conhecidos de outras investigações dando validade e eficácia da técnica experimental executada. Para determinar a localização sub-celular de lncRNAs foi desenvolvido um ensaio de hibridação in situ de fluorescência com base em sondas de LNA e amplificação do sinal de hibridação das sondas com base em sistemas que utilizam métodos enzimáticos associados a fluorescência. Neste caso, os resultados não foram conclusivos, precisando esta técnica experimental ser melhorada e optimizada. Os lncRNAs que serão analisados por estes ensaios, no futuro, serão fornecidos por meio de análise bioinformática do transcritoma de células T em diferentes fases de transformação leucémica. No final deste estudo iniciou-se esta análise bioinformática com dados de sequenciação de RNA (RNA-seq) obtidos de células T não transformadas e de células T em diferentes fases de transformação leucémica Nesta análise pretendeu-se ter uma ideia geral dos lncRNAs e mRNAs que se encontram diferencialmente expressos entre fases diferentes de transformação leucémica. Os resultados preliminares desta análise sugerem que existe uma percentagem maior de mRNAs diferencialmente expressos do que lncRNAs, quando se comparam células não transformadas com células em diferentes fases de transformação leucémica. O objectivo é identificar entre os lncRNAs diferencialmente expressos aqueles que poderão ser relevantes na transformação leucémica. Estes serão alvo de estudos funcionais utilizando as técnicas optimizadas neste estudo, de modo a que se perceba o seu mecanismo de acção e se possa avaliar se têm potencial para ser alvos para terapias direccionadas.
- Establishment of a protocol for the cryopreservation of cell sheets of adipose tissue stem cellsPublication . Prata, Fábio Emanuel Pires Aibéo; Marques, Alexandra P.; Tiscornia, GustavoA Engenharia de Tecidos é uma área interdisciplinar da Medicina Regenerativa que visa criar e desenvolver substitutos biológicos para reparar, manter ou melhorar a função de tecidos lesados, com base em princípios da engenharia conjugados às ciências da vida. A Engenharia de Tecidos tira partido das propriedades de estruturas tri-dimensionais (3D) que combinadas com células estaminais pretendem recriar um ambiente semelhante ao nativo de um tecido. Estas estruturas 3D (scaffolds) são produzidas com materiais de origem natural ou sintéticos, que idealmente terão as propriedades físicas, mecânicas e químicas para promoverem o melhor desempenho dessas células e portanto a regeneração dos tecidos. Na última decada as células estaminais mesenquimais foram amplamente utilizadas na Engenharia de Tecidos, pois têm o potencial de proliferarem e se manterem indiferenciadas com a capacidade de se auto-renovarem e/ou diferenciarem em diferentes tipos de células. Existem várias fontes de células estaminais com caracteristicas diferentes utilizadas em TE, em que as que apresentam maior impacto são as derivadas da medula espinal, do sangue e do tecido adiposo, entre outras localizadas em diferentes zonas do corpo humano. A combinação entre scaffolds e células estaminais mesenquimais apresentam algumas limitações tais como a indução de uma resposta inflamatória após transplante e o facto da grande maioria dos biomateriais utilizados não serem biofuncionais. A Engenharia de Cell sheets é a alternativa, pois utiliza a matriz extracelular depositada pelas células como scaffold natural para a regeneração de diferentes tecidos. O conceito de cell sheet foi introduzido por Teruo Okano e os seu colaboradores nos anos 90 no Japão. Estas cell sheets são produzidas em superficies revestidas com um polímero não iónico sensível à temperatura. Quando a temperatura é inferior a 32ºC a superficie fica hidrofílica, promovendo o destacamento das células em folha (cell sheets) sem recorrer ao uso do tradicional tratamento enzimático. Assim, esta tecnologia permite obter cell sheets com uma organização celular própria e coesiva, dado que as interações célula-celula e célula-matriz extracelular são mantidas. Em estudos anteriores no nosso laboratório foram produzidas cell sheets a partir das células estaminais humanas derivadas do tecido adiposo (hASCs). As cell sheets de hASCs quando transplantadas para feridas excisionais em pele de ratinho, induziram a formação de cristas epiteliais, normalmente apenas encontradas em pele humana, e a formação de um número significativo de folículos pilosos. Tendo em consideração estes resultados e antevendo as possibilidades de ter estas cell sheets disponiveis para uso imediato na clínica (off-the-shelf) a sua criopreservação seria vantajosa. Assim, o objectivo deste estudo foi definir um método de criopreservação que não só permita a preservação da viabilidade das hASCs mas também a integridade da matriz extracelular das cell sheets, que se sabe ser critico para garantir a sua funcionalidade, após transplantação. De modo a minimizar um potencial efeito adverso do processo de criopreservação, o método testado teve como base o método standard slow cooling rate, utilizado na criopreservação de células em suspensão. Foram então definidas duas condições de criopreservação, a condição standard, com 10% do crioprotector Dimethylsulfoxide (DMSO), e a condição exprimental, com 5% DMSO. Com o objectivo reduzir a toxicidade para as células criopreservadas. O efeito das condições de criopreservação na viabilidade celular foi analisado depois das cell sheets serem dissociadas, tendo sido demonstrado que ambas as condições de criopreservação não afectam de forma significativa a viabilidade celular. No entanto, verificou-se que a organização do citoesqueleto das células na cell sheet sofreu alterações depois da criopreservação em ambas as condições, verificando-se uma desorganização mais acentuada na condição standard. Verificou-se ainda que ambas as condições de criopreservação afetam a integridade da matriz extracelular das cell sheets, embora pareça que a condição standard afecte de um modo mais significativo. Mais ainda ambas as condições de criopreservação afectaram a quantidade total de proteínas. Potencialmente, este resultado está associado com as proteínas da matriz laminina, fibronectina e colagéneo I. De facto, a expressão destas proteínas excepto o colagéneo foi afectado tanto a nível molecular e proteico. Mais ainda verificamos a expressão dos seus genes por reacção em cadeia da polimerase (PCR). Onde a nível molecular o gene da laminina está sobre expressa em ambas as condições de criopreservação, o gene da fibronectina apenas na condição exprimental e o gene do colagéneo não sofre alterações significativas em ambas as condições de criopreservação. Considerando que as propriedades mesenquimais das células que compõe as cell sheets, são determinantes nos resultados previamente observados, a expressão dos marcadores típicos após a criopreservação foi analisado a nível genético e proteico, usando PCR e citometria de fluxo respectivamente. Com base nos resultados obtidos, que demonstram que a matriz extracelular é significativamente afectada pelo processo de criopreservação, será necessário testar diferentes protocolos e diferentes métodos de criopreservação, no sentido de se obter uma melhor preservação da integridade estrutural da cell sheet, e portanto garantir a sua funcionalidade após transplantação.
- Estudo da função da proteína Mob1 na estrutura dos centrossomasPublication . Sousa, Joana Patrícia Machado de; Tavares, ÁlvaroA proteína hsMob1 faz parte de uma família reguladora de cinases altamente conservada de levedura até ao Homem. Em termos de função a proteína hsMob1 parece ser a mais distante do resto da família, pois as proteínas da sua família regulam a mitose e citocinese, enquanto a proteína hsMob1 está implicada em processos de tráfego vesicular. Resultados preliminares do laboratório apontam uma função mitótica à proteína hsMob1, mais concretamente como sendo importante para estrutura dos centrossomas e fuso mitótico. Esses resultados também apontam para a função do hsMob1 na localização da CENP-A. A proteína CENP-A é a proteína que dá identidade ao centrómero e a partir da qual o cinetócoro se monta. Para perceber melhor a função do hsMob1, realizaram-se ensaios de RNAi e imunofluorescência para estudar os fenótipos e possíveis proteínas cuja localização poderia estar alterada. Antes do estudo dos fenótipos realizou-se uma experiência de localização, a qual revelou que a proteína é centrossomal ao longo do ciclo celular. Os fenótipos mitóticos observados sugerem que a proteína hsMob1 é importante para o alinhamento dos cromossomas, para a estrutura do fuso mitótico e para a localização da γ-tubulina nos centrossomas. A proteína hsMob1 não parece importante para a localização de proteínas Plk1 e Aurora B, que estão envolvidas na correção de erros entre os cinetócoros e microtúbulos evitando assim cromossomas desalinhados. Por outro lado, a proteína hsMob1 parece afetar a proteína centromérica CENP-C, que é uma proteína essencial na estabilização da CENP-A e importante para o recrutamento de outras proteínas que constituem o cinetócoro. Estes resultados sugerem que a proteína é importante para a normal progressão da mitose através do papel que desempenham na estrutura dos centrossomas e na possível montagem do cinetócoro.