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- Evaluation of MGP gene expression in colorectal cancerPublication . Caiado, Helena; Conceição, Natércia; Tiago, Daniel; Marreiros, Ana; Vicente, Susana; Enriquez, Jose Luis; Vaz, Ana Margarida; Antunes, Artur; Guerreiro, Horacio; Caldeira, Paulo; Leonor Cancela, M.Purpose: Matrix Gla protein (MGP) is a vitamin K-dependent, gamma-carboxylated protein that was initially found to be a physiological inhibitor of ectopic calcifications affecting mainly cartilage and the vascular system. Mutations in the MGP gene were found to be responsible for a human pathology, the Keutel syndrome, characterized by abnormal calcifications in cartilage, lungs, brain and vascular system. MGP was recently implicated in tumorigenic processes such as angiogenesis and shown to be abnormally regulated in several tumors, including cervical, ovarian, urogenital and breast. This fact has triggered our interest in analyzing the expression of MGP and of its regulator, the transcription factor runt related transcription factor 2 (RUNX2), in colorectal cancer (CRC). Methods: MGP and RUNX2 expression were analyzed in cancer and non-tumor biopsies samples from 33 CRC patients and 9 healthy controls by RT-qPCR. Consequently, statistical analyses were performed to evaluate the clinical-pathological significance of MGP and RUNX2 in CRC. MGP protein was also detected by immunohistochemical analysis. Results: Showed an overall overexpression of MGP in the tumor mucosa of patients at mRNA level when compared to adjacent normal mucosa and healthy control tissues. In addition, analysis of the expression of RUNX2 mRNA demonstrated an overexpression in CRC tissue samples and a positive correlation with MGP expression (Pearson correlation coefficient 0.636; p <= 0.01) in tumor mucosa. However correlations between MGP gene expression and clinical-pathological characteristics, such as gender, age and pathology classification did not provide relevant information that may shed light towards the differences of MGP expression observed between normal and malignant tissue. Conclusions: We were able to associate the high levels of MGP mRNA expression with a worse prognosis and survival rate lower than five years. These results contributed to improve our understanding of the molecular mechanism underlying MGP deregulation in cancer.
- Functional analysis of a transcriptional variant of matrix gla protein (MGP)Publication . Caiado, Helena; Tiago, Daniel; Conceição, NatérciaEm Portugal, o adenocarcinoma do cólon apresenta uma taxa de prevalência em relação a outros tumores de 10%, e em média, morrem 9 a 10 pacientes por dia. Embora este tipo de tumor seja diagnosticado já numa fase mais avançada e sintomática da doença, com uma progressão em cerca de 10 anos, o prognóstico permanece reservado. Contudo, se diagnosticado num estadio mais precoce, a taxa de sobrevivência para um período de 5 anos apresenta valores acima dos 50%, tanto para homens como para mulheres. De acordo com os dados publicados pelo Registo Oncológico do Sul (ROR-Sul) 81% e 71% dos casos foram diagnosticados por volta dos 60 anos em homens e mulheres, respectivamente. Existem duas formas principais para o aparecimento do adenocarcinoma do cólon, nomeadamente, a forma relacionada com o aparecimento esporádico com origem em mutações em células somáticas (mais de 95% dos casos) e a forma associada à herança de mutações em células da linha germinal (forma hereditária). Associadas às mutações transmitidas através de células da linha germinal, temos a síndrome da polipose adenomatosa familiar (FAP) e o síndrome não polipoide hereditário ou síndrome de Lynch. No caso da síndrome adenomatosa familiar, esta é uma doença hereditária autossómica dominante, e é caracterizada por 1) aparecimento de milhares de tumores pré-neoplásicos (pólipos) ao longo de todo o tubo digestivo e 2) aparecimento numa idade jovem (40 anos). Associada a esta doença está também o gene supressor de tumores APC, responsável maioritariamente pela proliferação celular e activação de vias de sinalização apoptóticas. Quando existe uma perda por heterozigotia (LOH) do restante alelo funcional este síndrome tem maior risco de vir a dar origem a um adenocarcinoma. Existem ainda outros tipos de síndromes associados a este tipo e doença, nomeadamente, a síndrome de Gardner, a hipertrofia congénita do pigmento da retina e a forma mais suave da polipose adenomatosa familiar. Em relação à síndrome de Lynch esta difere da FAP pelo tipo de mutações encontradas em genes associados a mecanismos de reparação do ADN como é o caso do MLH1 e MSH2 e por não apresentar pólipos pré-neoplásicos em grande número. Já a forma do adenocarcinoma do cólon esporádico, está relacionado com o aparecimento de mutações pontuais em células somáticas, que podem ser causadas por fatores subjacentes ao dia-a-dia do paciente. No entanto é de salientar que para ambas as formas de manifestação do adenocarcinoma do cólon, é necessário ocorrer um primeiro evento carcinogénico que altere o normal funcionamento da célula. No que diz respeito aos métodos de rastreio para este tipo de tumores, os melhores continuam ainda a ser a sigmoidoscopia e colonoscopia total. No entanto, o avanço das técnicas em biologia molecular tem vindo a permitir a descoberta de novos genes que estejam envolvidos na regulação tumoral e que no futuro possam ser considerados possíveis biomarcadores para uma deteção mais precoce e possíveis alvos terapêuticos, a fim de diminuir a mortalidade ainda associada a este tipo de tumores. A MGP (Proteína Gla da matrix) é uma proteína extracelular cuja principal função está associada à inibição da calcificação das artérias e cartilagem. No cancro, embora tenha sido demonstrada uma sobre-expressão da MGP numa variedade de tumores, como o cancro do ovário, da mama, glioblastomas, entre outros, o seu papel permanece pouco claro,. Especificamente, no adenocarcinoma do cólon foi anteriormente demonstrada uma desregulação da MGP, embora de forma pouco consistente. Como tal o principal objetivo deste trabalho incidiu sobre a análise de expressão do gene MGP, bem como a análise de alguns possíveis fatores de transcrição associados à sua regulação em amostras do adenocarcinoma do cólon. Para tal, amostras de mucosa normal e tumoral de 20 pacientes foram analisadas por PCR em tempo real. Os resultados demonstraram haver uma forte tendência para a sobre-expressão da MGP a nível do mRNA (P= 0.056) em biópsias do adenocarcinoma do cólon em comparação com as biópsias de mucosa normal, contrariando resultados anteriores indicando uma regulação negativa feste gene. Os resultados aqui apresentados são no entanto consistentes com uma elevada expressão da MGP (níveis idênticos aqueles que foram observados na mucosa tumoral das amostras dos pacientes com adenocarcinoma do colon) Tendo em conta estes resultados, procedeu-se então à análise da expressão de fatores de transcrição que têm sido descritos na literatura como tendo um papel na regulação da MGP e em alguns casos também na tumorigénese. Dos resultados obtidos, constatou-se um aumento da expressão dos genes do RUNX2 (p = 0,037) e CCBE1 (p = 0,012) em amostras de adenocarcinoma do cólon. Para os genes do FGF2 (p = 0,085) e RARa (p = 0,58) os resultados não apresentaram valores estatisticamente significativos. No entanto, verificou-se que existia uma correlação de Pearson positiva (r = 0,89, p≤0.0001 para o FGF2 e r = 0,85 , p ≤0.0001 para o RARa), demonstrando assim uma forte tendência para o aumento da regulação simultânea desses fatores de transcrição e da MGP. Em suma, a MGP encontra-se sobre expressa nas amostras no adenocarcinoma do cólon, no entanto não é possível estabelecer quais os mecanismos de regulação que estão a ser desregulados e se um pior prognóstico poderá estar associado a esta desregulação. Para isso, será necessário no futuro realizar i) uma análise mais alargada em número de pacientes, e ii) uma análise mais profunda sobre como esses genes interagem entre si. Será também importante analisar quais os efeitos de um bloqueio da expressão da MGP na linha celular de adenocarcinoma de cólon, bem como testar os efeitos dos fatores de transcrição identificados no promotor da MGP.