CHARACTERIZATION OF PHYLOGENETICALLY DISTINCT SILENCING SUPPRESSORS OF CITRUS TRISTEZA VIRUS AND ASSESSMENT OF THE POSSIBILITY OF THEIR INHIBITION

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Combined expression of p20 and p23 proteins from Citrus tristeza virus show enhanced local silencing suppressor activity

Publication . Costa, Angela A.; Martins, Tatiana R.; Marques, N T.; Nolasco, Gustavo; Firenze University Press

Viruses developed a strategy to counter-defence the posttranscriptional gene silencing mechanism (PTGS) based on the activity of silencing suppressor proteins. Citrus tristeza virus (CTV), a member of the genus Closterovirus, has two suppressor proteins (p20 and p23) that target the local RNA silencing response of the host. In GFP transient co-expression assays performed on Nicotiana benthamiana 16C plants, local suppressor activity of p23 and p20 was similar. Co-expression of both proteins from a mild or a stem pitting CTV isolate showed stronger local suppression activity than either suppressor alone, with an increased GFP transcript level six-(for Gp M) to nine-fold (for Gp 3a) higher than non-inoculated 16C plants, in parallel with low accumulation of siRNAs. Further, GFP brightness of leaves infiltrated with Agrobacterium cultures at an OD600 of 0.5 was comparable to those infiltrated with OD600 0.25. These findings indicate that combined action of p20 and p23 proteins results in enhanced suppressor activity.

2016Journal article

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Caraterização dos supressores p20 e p23 do Citrus tristeza virus e avaliação da possibilidade da sua inibição

Publication . Costa, Ângela Maria Araújo da; Nolasco, Gustavo; Marques, Natália Tomás

No presente trabalho pretendeu-se caracterizar a capacidade supressora das proteínas p20 e p23 de diferentes grupos filogenéticos do CTV e o possível silenciamento da p23 de forma a ser incluída numa estratégia de proteção. A atividade supressora local da proteína p23 de todos os grupos filogenéticos foi caracterizada em Nicotiana benthamiana da linha 16C. Todas as proteínas testadas foram capaz de suprimir o silenciamento local, mas não o silenciamento a curta distância. A supressão local mais eficiente verificou-se para a p23 do Gp 5 e a menos eficiente para os isolados dos Gps 2 e M. Surpreendentemente, a p23 do Gp 5 aboliu completamente o silenciamento sistémico, sugerindo que existe uma relação entre a intensidade do silenciamento local e sistémico. A capacidade supressora local conjunta das proteínas p20 e p23 foi avaliada. A coexpressão de ambas as proteínas revelou atividade supressora mais forte comparada com a capacidade de cada proteína individual, mesmo quando inoculada com metade da densidade ótica, sugerindo a existência de sinergismo entre as proteínas p20 e p23. Para analisar as propriedades supressoras a longo prazo, as proteínas p20 e p23 foram inseridas no vetor viral TRV que assegurou a sua disseminação pela planta e expressão por um período mais alargado. Foram observados sintomas em N. benthamiana para todas as modalidades testadas, tais como, nanismo da planta, lesões necróticas severas nas folhas inoculadas e nas folhas novas ligeiros sintomas de mosaico e enrolamento. Contudo, sistemicamente não foram registadas diferenças na capacidade supressora das proteínas p20 e p23. A possibilidade para silenciar sistemicamente a proteína p23 quando incluída num genoma viral foi avaliada através do uso de plantas e enxertos transgénicos para a p23. A estratégia que envolve o uso de enxertos transgénicos parece indicar resultados promissores que conduzem ao silenciamento da p23, contudo, são resultados que devem ser encarados como preliminares.

2014Doctoral thesis

Open Access