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Research Project
DEVELOPMENT OF POLYSACCHARIDE-BASED CARRIERS FOR PULMONARY TUBERCULOSIS THERAPY
Funder
Authors
Publications
Dual antibiotherapy of tuberculosis mediated by inhalable locust bean gum microparticles
Publication . Rodrigues, Susana; Alves, Ana D.; Cavaco, Joana S.; Pontes, Jorge Filipe; Guerreiro, Filipa; Rosa Da Costa, Ana; Buttini, Francesca; Grenha, Ana
Despite the existence of effective oral therapy, tuberculosis remains a deadly pathology, namely because of bacterial resistance and incompliance with treatments. Establishing alternative therapeutic approaches is urgently needed and inhalable therapy has a great potential in this regard. As pathogenic bacteria are hosted by alveolar macrophages, the co-localisation of antitubercular drugs and pathogens is thus potentiated by this strategy. This work proposes inhalable therapy of pulmonary tuberculosis mediated by a single locust bean gum (LBG) formulation of microparticles associating both isoniazid and rifabutin, complying with requisites of the World Health Organisation of combined therapy. Microparticles were produced by spray-drying, at LBG/INH/RFB mass ratio of 10/1/0.5. The aerodynamic characterisation of microparticles revealed emitted doses of more than 90% and fine particle fraction of 38%, thus indicating the adequacy of the system to reach the respiratory lung area, thus partially the alveolar region. Cytotoxicity results indicate moderate toxicity (cell viability around 60%), with a concentration-dependent effect. Additionally, rat alveolar macrophages evidenced preferential capture of LBG microparticles, possibly due to chemical composition comprising mannose and galactose units that are specifically recognised by macrophage surface receptors. (C) 2017 Elsevier B.V. All rights reserved.
Biocompatibility and stability of polysaccharide polyelectrolyte complexes aimed at respiratory delivery
Publication . Rodrigues, Susana; Cardoso, Lurdes; Costa, Ana M. Rosa da; Grenha, Ana
Chitosan (CS) and chondroitin sulfate (CHS) are natural polymers with
demonstrated applicability in drug delivery, while nanoparticles are one of the most explored
carriers for transmucosal delivery of biopharmaceuticals. In this work we have prepared
CS/CHS nanoparticles and associated for the first time the therapeutic protein insulin.
Fluorescein isothiocyanate bovine serum albumin (FITC-BSA) was also used to enable
comparison of behaviors regarding differences in molecular weight (5.7 kDa versus 67 kDa).
Nanoparticles of approximately 200 nm and positive zeta potential around +20 mV were
obtained. These parameters remained stable for up to 1 month at 4 C. Proteins were
associated with efficiencies of more than 50%. The release of FITC-BSA in PBS pH 7.4
was more sustained (50% in 24 h) than that of insulin (85% in 24 h). The biocompatibility
of nanoparticles was tested in Calu-3 and A549 cells by means of three different assays.
The metabolic assay MTT, the determination of lactate dehydrogenase release, and the
quantification of the inflammatory response generated by cell exposure to nanoparticles have
indicated an absence of overt toxicity. Overall, the results suggest good indications on the
application of CS/CHS nanoparticles in respiratory transmucosal protein delivery, but the set
of assays should be widened to clarify obtained results.
Development of polysaccharide-based carriers for pulmonary tuberculosis therapy
Publication . Rodrigues, Susana Isabel Guerreiro; Grenha, Ana
A tuberculose é uma doença infeciosa provocada pelo Mycobacterium
tuberculosis. A transmissão da bactéria ocorre por via inalatória, após o que a
mesma se aloja nos macrófagos existentes na região alveolar. A bactéria tem a
capacidade de sobreviver e multiplicar-se mesmo depois de fagocitada pelos
macrófagos alveolares, podendo ficar em estado latente por vários meses e até
anos. Apesar de existir uma vacina contra a doença, a denominada BCG, de
Bacillus Calmette-Guérin, esta não é totalmente eficaz e muitas pessoas
desenvolvem a doença apesar de imunizadas. A tuberculose continua a ser a
principal causa de morte evitável a nível mundial e está a reaparecer na Europa,
estando muito associada aos casos de co-morbilidade com o vírus da
imunodeficiência humana (VIH). Segundo a Organização Mundial de Saúde
(OMS), a terapia da tuberculose é obrigatoriamente combinada, para potenciar
a eficácia do tratamento. Neste contexto, a isoniazida (INH) e a rifabutina (RFB)
são dois dos fármacos de primeira linha utilizados, a última usada
particularmente nos casos em que o doente apresenta também infeção por VIH.
Estas moléculas apresentam características diferentes, nomeadamente em
termos de massa molecular e afinidade aquosa. A INH é uma molécula hidrofílica
com 137 g/mol, enquanto a RFB tem 847 g/mol e é hidrofóbica, exigindo
solventes orgânicos ou soluções ácidas para dissolver.
Considerando a tuberculose pulmonar como a principal manifestação da doença,
a administração direta de antibióticos ao pulmão e, particularmente, aos
alvéolos, onde residem os macrófagos que atuam como hospedeiros da bactéria,
compreende uma abordagem muito promissora, permitindo a entrega de
fármacos no local primário da infeção. Esta estratégia implica o desenvolvimento
de formulações para inalação, requerendo o uso de transportadores de fármacos
que exibam propriedades aerodinâmicas adequadas para alcançar a região
alveolar, onde residem os macrófagos que podem, assim, internalizar os
fármacos. A literatura mostra que, para alcançar esta zona do pulmão, os
transportadores devem ter um diâmetro aerodinâmico entre 1 e 5 μm. Na
realidade, devido à geometria dos pulmões, as partículas a utilizar como
transportadores precisam de ter um tamanho suficientemente pequeno para
entrar nas vias aéreas inferiores, mas a sua massa deve ser suficiente para impedir que sejam exaladas juntamente com o ar expirado, o que justifica o
intervalo de diâmetros referido anteriormente e a frequente utilização de
micropartículas para inalação. A opção pela utilização de transportadores como
veículos dos fármacos requer também que a matriz constituinte das partículas
seja o mais inerte possível, não induzindo toxicidade ou reações de inflamação.
Neste sentido, os materiais de origem natural e, particularmente, os polímeros
como os polissacáridos, são reportados como tendo maior probabilidade de
exibir biocompatibilidade e biodegradabilidade, duas características essenciais
para uma aplicação na área da administração de fármacos. Considerando que o
agente patogénico se aloja nos macrófagos alveolares, os fármacos devem
alcançar este compartimento intracelular antes de ocorrer a sua libertação a
partir do transportador inalado, o que ficará facilitado pela internalização dos
próprios transportadores pelas células. Para melhorar este processo de
internalização, alguns trabalhos reportam a funcionalização da superfície das
partículas com ligandos que são reconhecidos pelos recetores dos macrófagos.
Alguns polímeros naturais apresentam uma importante vantagem a esse
respeito, sendo compostos por unidades estruturais que são reconhecidas
diretamente por vários recetores dos macrófagos. O sulfato de condroitina (ChS)
e a k-carragenina (CRG) são dois exemplos desses polímeros naturais. O
primeiro é composto por unidades alternadas de N-acetilgalactosamina e ácido
glucurónico, enquanto o último contém resíduos de galactose-4-sulfato e
galactose anidra. Ambos estão reportados como sendo reconhecidos
especificamente pelos macrófagos, bem como por proporcionarem a ativação
destas células.
Neste trabalho, foram produzidas micropartículas por um processo de
atomização, as quais contêm os fármacos modelo (INH e RFB) de forma
combinada, respeitando assim as indicações da Organização Mundial da Saúde.
Os fármacos foram sempre associados às micropartículas numa razão de massa
polímero/INH/RFB de 10/1/0.5. À formulação produzida com CRG, adicionou-se
um outro polímero de matriz de forma a mitigar o potencial inflamatório que tem
sido reportado para a CRG na literatura. As micropartículas foram, neste caso,
preparadas com uma relação de massa de amido/CRG de 8/2. Esta formulação
obteve um rendimento de produção de 70% e associou efetivamente 96% da
INH e 74% da RFB. Ao analisar o diâmetro aerodinâmico foi verificado que este variou entre 3.3 μm e 3.9 μm e obteve-se uma percentagem de partículas finas
de 32% - 38%. Estes valores seriam satisfatórios não fosse a deposição de
aproximadamente 50% das partículas na zona correspondente à garganta. Por
esse motivo, identificou-se a necessidade de aperfeiçoamento desta formulação
para utilização futura. Por outro lado, para as micropartículas compostas por ChS
como material de matriz, foram testados dois solventes (etanol e ácido clorídrico)
para solubilização da RFB, avaliando-se qual dos dois conduz à obtenção de
partículas com melhores características. Ambas as formulações evidenciaram
micropartículas de forma esférica, com uma superfície tendencialmente mais
rugosa após a associação dos fármacos. Os rendimentos de produção foram
bastante satisfatórios, na ordem dos 80%, e os fármacos foram associados com
eficácia de 95% para INH e 59-69% para RFB. Apesar de ambas as formulações
apresentarem diâmetros aerodinâmicos semelhantes (3.8 – 4.0 μm), as
micropartículas produzidas com etanol demonstraram melhores resultados,
registando uma maior percentagem de partículas finas (43% contra 35% nas
micropartículas preparadas com HCl), o que reflete melhor capacidade para
alcançar a região respiratória e uma maior dose de fármaco contida na fração de
partículas finas que alcançarão a zona alveolar. Acresce que esta formulação
permitiu ainda maior controlo sobre a libertação dos fármacos associados,
nomeadamente da RFB. Desta forma, a formulação de micropartículas em que
o etanol foi utilizado como solvente, foi selecionada para prosseguir os ensaios
de biocompatibilidade em células. Na formulação de micropartículas com matriz
à base de amido/CRG não foi possível testar a utilização de etanol, uma vez que
o protocolo de preparação implica o recurso a um banho de água quente durante
o processo de atomização, o qual levaria à evaporação do solvente. Assim se
justifica que essas micropartículas tenham sido produzidas unicamente com
ácido clorídrico como co-solvente.
A atividade inibitória dos fármacos modelo contra a M. bovis BCG foi mantida
após o processo de microencapsulação por atomização em todas as
formulações, independentemente dos materiais de matriz e dos solventes
utilizados, o que indica a adequação do método de produção das
micropartículas. Por forma a avaliar o perfil de citotoxicidade das micropartículas
desenvolvidas, foram realizados ensaios em diferentes linhas celulares
humanas, variando concentrações e tempos de exposição (até 24 h). As micropartículas foram testadas em células epiteliais alveolares (A549) e em
macrófagos derivados de monócitos (dTHP-1), ambos de grande relevância no
contexto da tuberculose pulmonar. Verificou-se que as micropartículas
compostas por amido/CRG podem apresentar algumas limitações, com algum
nível de toxicidade indesejável, ao contrário das micropartículas com matriz de
ChS, que mantiveram os níveis de viabilidade celular acima de 70% em todas as
condições testadas. Os macrófagos derivados de monócitos foram ainda
utilizados para testar quer a capacidade das células para capturar as
micropartículas, quer a capacidade das últimas para induzir a ativação dos
macrófagos. O ensaio de captura macrofágica demonstrou que, em comparação,
as micropartículas de ChS conseguem um maior nível de internalização para um
tempo de exposição e uma dose semelhante. Por outro lado, a produção de
interleucinas (TNF-α e IL-8) pelas células foi mais pronunciada após contacto
com as micropartículas de amido/CRG, indicando uma maior apetência destas
para ativar os macrófagos mesmo a concentrações mais baixas.
Considerando os bons resultados obtidos com as micropartículas com matriz de
ChS, a avaliação do seu perfil toxicológico foi aprofundada por meio da
realização de um estudo multiparamétrico, o qual recorreu à utilização de
macrófagos de ratinho (células J774A.1). O estudo envolveu a incubação das
células com concentrações não tóxicas dos materiais, realizando-se
posteriormente, por microscopia de fluorescência, uma análise de conteúdos
específicos que indicam a resposta celular. Os parâmeros analisados foram a
atividade mitocondrial, a área da célula, a área do núcleo, a permeabilidade da
membrana, o conteúdo de fosfolípidos (fosfolipidose) e o conteúdo de lípidos
neutros (esteatose). Após incubação com as micropartículas de ChS (produzidas
com etanol), não foi verificada nenhuma alteração nos parâmetros estudados.
Apenas para a RFB na forma livre se verificou uma alteração da quantidade de
fosfolípidos existentes quando comparado com o controlo de células não
expostas. Contudo, estas alterações apenas se verificaram em concentrações
de fármaco muito mais elevadas do que as presentes nas micropartículas, pelo
que se acredita que a níveis terapêuticos não ocorrerão as alterações
verificadas, o que foi sugerido também quando se testaram as micropartículas
com fármaco. Foi realizado também um estudo preliminar in vivo em ratinhos BALB/c, no qual
os animais foram expostos a micropartículas sem fármaco. Devido ao facto dos
materiais de matriz utilizados neste trabalho, o sulfato de condroitina e o
amido/CRG, não terem utilização reportada para via inalatória, considerou-se
relevante fazer uma análise preliminar da resposta dos animais ao contacto com
os mesmos. Foram testadas as micropartículas quer de ChS, quer de
amido/CRG, as quais foram administradas aos ratinhos por inalação, num total
de dez aplicações num intervalo temporal de duas semanas. Após o sacrifício
dos animais foi avaliado o índice tecidular de diferentes órgãos, nomeadamente
fígado, pulmão e rim, e realizada a análise de esfregaços sanguíneos, de modo
a verificar o tipo de leucócitos presentes. Não foram observadas alterações do
índice tecidular de nenhum dos órgãos analisados, nem se registaram
modificações das percentagens dos vários leucócitos constituintes do sangue,
para nenhuma das formulações de micropartículas. Os níveis séricos de ALT,
AST e LDH, marcadores de alterações tecidulares, também não demonstraram
alterações significativas, o que indica a tolerância dos animais ao contacto com
as micropartículas e os seus materiais constituintes.
As formulações desenvolvidas ao longo deste trabalho demonstraram possuir
características adequadas para a entrega de fármacos por via inalatória, com o
propósito de alcançar a região alveolar e proporcionar um direcionamento para
os macrófagos. No geral, a formulação com matriz de sulfato de condroitina
(ChS/INH/RFB), produzida utilizando etanol como co-solvente, foi a que
demonstrou melhores propriedades, sendo aquela identificada como tendo mais
potencial.
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