Structure and function of elicitins and their role in the infection of the cork oak by the fungus Phytophthora cinnamomin

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Produção de elicitinas recombinantes de Phytophthora cinnamomi

Publication . Sousa, Nelson Guerreiro Mendes de; Cravador, Alfredo Jaime Morais e

A doença do declínio do sobreiro é um fenómeno complexo que provoca uma diminuição visível do vigor vegetativo da árvore. O fungo Phytophthora cirmamomi está associado a esta doença radicular, provocando a morte maciça das raízes finas, reduzindo acentuadamente a capacidade das árvores para absorver água e substâncias nutritivas do solo, conduzindo ao enfraquecimento gradual das extremidades dos ramos e à queda das folhas. As elieitinas são um grupo de holoproteínas altamente conservadas segregadas por espécies do género Phytophthora (com a excepcção da Phytophthora parasitica var. nicotianae) e por Pythium vexans. Estes polipeptídeos de baixa massa molecular ( ~ 10,3 kDa), constituídas por 98 aminoácidos, induzem uma resposta de hipersensibilidade e resistência sistémica adquirida em espécies de plantas sensíveis. A função das elieitinas na biologia das espécies Phytophthora ainda não é clara, não se sabendo se estas proteínas contribuem directamente para a patogenicidade das espécies Phytophthora. O presente trabalho foi dividido em três partes. Na primeira parte, extraiu-se o RNA total de micélio de P. cirmamomi, a partir do qual se sintetizaram e amplificaram, por PCR, os ORF°s (“Operi Reading Frame ”) dos quatro genes do cluster recorrendo a primers específicos. Os produtos da amplificação foram sujeitos a uma análise de restrição enzimática. Na segimda parte, fez-se um estudo da expressão de elieitinas de diferentes isolamentos de duas espécies de Phytophthora. A análise deste estudo mostrou que o isolamento Pa20 de P. cirmamomi expressa uma maior quantidade de elieitinas e num intervalo de tempo menor, em comparação com os isolamentos estudados de P. cambivora. Na terceira parte, produziu-se B-cinamomina e ot-cinamomina heterólogas. Com o recurso a células de Pichia pastoris, previamente transformadas com o ORF do gene da B-cinamomina induziu-se a expressão da respectiva proteína. Os sobrenadantes contendo a B-cinamomina passaram por mn processo de purificação que incluiu: concentração, diálise, cromatografia de troca iónica e Fast Protein Liquid Chromatngmphy (FPLC). A análise da B-cinamomina foi feita através de SDS-PAGE e immunobloting.

2004-05Master thesis

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