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Assessing the Impact of induced mesenchymal stem cells secretome in a 3D in vitro model of Parkinson's disease
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Abstract(s)
Parkinson’s disease (PD) is a complex disease characterized by a loss of dopaminergic (DA) neurons that leads to lifelong motor and non-motor impairments, still with no efficient treatment that can halt or revert its progression. Mesenchymal stem cells (MSCs) have been proposed as a promising therapeutic strategy to prevent dopaminergic neurons degeneration, particularly due to their paracrine action. Induced MSCs (iMSCs), obtained from induced pluripotent stem cells (iPSCs) differentiation, present an advantageous cell source for obtaining large amounts of secretome due to their superior proliferative capacity. In this project, we aimed to (1) develop a 3D in vitro model for the study of PD, (2) compare the long-term culture of iMSCs in either a commercial serum-free (SF) medium or a human platelet lysate (hPL) supplemented medium, (3) compare the effects of secretome from iMSCs expanded in different media and from early and late passages on dopaminergic differentiation, and (4) compare the effects of these secretomes on neuroprotection of a 3D in vitro model of PD. Results showed that the developed 3D collagen model demonstrated a robust network of neurons, that, when challenged with a toxin, resulted in a suitable PD model. hPL supplementation induces a higher proliferative capacity and lower levels of replicative senescence of iMSCs. The proteomic analysis reveals a secretory profile similar between iMSCs cultured in these two media, with a smaller portion of proteins that could be relevant for neuroregenerative processes being differentially expressed between them. Secretome from early passage iMSCs expanded in hPL supplemented medium had a positive impact on dopaminergic differentiation that other secretomes. The impact of these secretomes on the developed 3D model of PD did not show differences. Results show that the modulation of iMSCs secretome through expansion in different media and collection at different cell passages can influence therapeutic potential for PD.
A Doença de Parkinson (PD) é uma doença neurodegenerativa complexa que está associada à perda de neurónios dopaminérgicos, levando a uma progressiva perda da capacidade motora. O tratamento para esta doença é maioritariamente sintomático, pelo que é necessário encontrar uma estratégia terapêutica eficaz que permita parar ou até reverter a progressão desta doença. Diversos estudos experimentais com base no uso de secretoma de células estaminais mesenquimatosas (MSCs) têm vindo a demonstrar diversos benefícios da sua utilização, tais como na neurogénese, na imunomodulação, na neuroprotecção e até na redução de agregados de α-sinucleína, uma das marcas características de PD. Estes resultados suportam o potencial do secretoma de MSCs como uma possível estratégia terapêutica para PD, no entanto, as MSCs retiradas de tecido adulto raramente são suficientes para a posterior utilização em ensaios clínicos e pré-clínicos, dada a sua capacidade proliferativa limitada. As MSC derivadas a partir de células estaminais pluripotentes induzidas (iMSCs) representam uma forma não exaustiva de obter elevados números de MSCs, removendo adicionalmente a necessidade de efetuar procedimentos invasivos para a sua colheita. Estudos prévios demonstraram que a expansão de MSCs em diferentes meios pode resultar na alteração de propriedades destas células, tais como a sua morfologia, capacidade proliferativa e o processo de senescência. Estas alterações podem ter implicações nas aplicações terapêuticas do secretoma coletado de MSCs expandidas em diferentes meios, pelo que se torna também necessário avaliar estas condicionantes relativamente às iMSCs. Desta forma, neste trabalho pretendeu-se: em primeiro lugar, desenvolver um modelo in vitro 3D e proceder à sua caracterização com vista ao seu emprego no estudo de PD; de seguida comparar a cultura a longo prazo de iMSCs em diferentes meios, correspondendo um a meio comercial sem soro e outro a meio suplementado com lisado de plaquetas humanas (hPL); posteriormente comparar os efeitos dos secretomas de iMSCs em diferentes passagens celulares e expandidas em diferentes meios na diferenciação dopaminérgica; e por fim comparar os efeitos destes secretomas na neuroprotecção de um modelo in vitro 3D onde foi induzida a degeneração dopaminérgica característica de PD. Um modelo in vitro 3D foi desenvolvido através da cultura de corpos embrioides orientada para a diferenciação dopaminérgica em hidrogéis de colagénio e posteriormente caracterizado qualitativamente e quantitativamente. Esta caracterização resultou na revelação de um modelo com a presença de uma rede neuronal robusta e com uma organização espacial 3D que mais se assemelha ao cérebro do que a organização refletida pela cultura celular 2D realizada. Uma porção das células obtidas foi identificada como neurónios dopaminérgicos (DA) maduros, o que revelou uma diferenciação bem-sucedida de células estaminais embrionárias de murganho (mESCs) em neurónios DA. Para além do uso de hidrogéis de colagénio, um scaffolds de origem natural, para o desenvolvimento deste modelo 3D, um outro scaffold alternativo, de origem sintética (baseado em Ormocomp), foi testado também. Os respetivos resultados sugeriram que ambos são capazes de suportar uma cultura celular 3D direcionada para a diferenciação dopaminérgica, apesar de o modelo 3D em colagénio ter tido uma capacidade superior para tal. A otimização da cultura 3D nestes dois scaffolds é, no entanto, necessária para futuros trabalhos experimentais, principalmente na cultura na estrutura baseada em Ormocomp. Devido à maior capacidade do modelo 3D em colagénio para originar neurónios dopaminérgicos, esse foi o modelo utilizado para posteriormente explorar os efeitos do secretoma coletado de iMSCs expandidas em diferentes meios e de diferentes passagens celulares. Os resultados obtidos acerca da cultura a longo prazo de iMSCs revelaram que as propriedades destas células podem ser moduladas através do uso de diferentes meios, tendo sido utilizados neste caso um meio comercial quimicamente definido e livre de componentes animais e um meio suplementado por hPL. A expansão de iMSCs em meio suplementado com hPL demonstrou uma maior capacidade proliferativa destas células e menores níveis de senescência na fase inicial da cultura assim como na fase final. A avaliação do perfil secretório das iMSCs expandidas nestes dois meios demonstrou a presença de proteínas com relevância terapêutica, incluindo, por exemplo, proteínas com atividade catalítica ou antioxidante, e proteínas relacionadas com a matriz extracelular (ECM) e interação célula-a-célula que podem ter funções na regeneração de tecidos e neuroprotecção. O perfil secretório analisado demonstrou-se, na maior parte, semelhante para as duas condições, sendo que apenas uma pequena parte das proteínas se encontrava significativamente diferencialmente expressa entre as duas condições. Algumas das proteínas detetadas como diferencialmente expressas estavam associadas à matriz extracelular com funções relacionadas com adesão celular e outras com a linhagem neuronal e neurogénese. A avaliação dos efeitos do secretoma de iMSCs expandidas em diferentes meios e de diferentes passagens celulares foi realizada recorrendo ao modelo 3D em colagénio. Esta revelou que secretoma de iMSCs de passagem inicial expandidas em meio suplementado com hPL é capaz de promover crescimento axonal e diferenciação dopaminérgica com sucesso, tendo os seus efeitos sido em parte similares aos promovidos pelo meio positivo de diferenciação dopaminérgica. Secretoma de iMSCs de passagem tardia expandidas em meio suplementado com hPL teve efeitos menos positivos nestes mesmos aspetos. Secretoma de iMSCs de passagem inicial expandidas em meio comercial de composição definida sem componentes animais também teve uma menor capacidade relativamente à promoção de diferenciação dopaminérgica. Estes resultados confirmam que não só o meio em que as iMSCs são expandidas, como também a passagem celular em que o secretoma é coletado, podem modular as propriedades terapêuticas destas células. A exposição do modelo 3D em colagénio a uma toxina, 6-OHDA, levou ao desenvolvimento de um modelo in vitro capaz de refletir a degeneração dopaminérgica presente em PD. Os efeitos do secretoma de iMSCs na neuroprotecção foram testados neste modelo de PD. Os resultados não demonstraram diferenças visíveis ou estatisticamente significativas na viabilidade da cultura entre o grupo veículo e o grupo sujeito à toxina. Em suma, estes resultados demonstram que as iMSCs podem ser moduladas por forma não só a aumentar o número de células passíveis de serem obtidas como também de forma a potenciar algumas das suas aplicações terapêuticas, como a sua capacidade de diferenciação dopaminérgica, relevando o seu potencial terapêutico em doenças como PD.
A Doença de Parkinson (PD) é uma doença neurodegenerativa complexa que está associada à perda de neurónios dopaminérgicos, levando a uma progressiva perda da capacidade motora. O tratamento para esta doença é maioritariamente sintomático, pelo que é necessário encontrar uma estratégia terapêutica eficaz que permita parar ou até reverter a progressão desta doença. Diversos estudos experimentais com base no uso de secretoma de células estaminais mesenquimatosas (MSCs) têm vindo a demonstrar diversos benefícios da sua utilização, tais como na neurogénese, na imunomodulação, na neuroprotecção e até na redução de agregados de α-sinucleína, uma das marcas características de PD. Estes resultados suportam o potencial do secretoma de MSCs como uma possível estratégia terapêutica para PD, no entanto, as MSCs retiradas de tecido adulto raramente são suficientes para a posterior utilização em ensaios clínicos e pré-clínicos, dada a sua capacidade proliferativa limitada. As MSC derivadas a partir de células estaminais pluripotentes induzidas (iMSCs) representam uma forma não exaustiva de obter elevados números de MSCs, removendo adicionalmente a necessidade de efetuar procedimentos invasivos para a sua colheita. Estudos prévios demonstraram que a expansão de MSCs em diferentes meios pode resultar na alteração de propriedades destas células, tais como a sua morfologia, capacidade proliferativa e o processo de senescência. Estas alterações podem ter implicações nas aplicações terapêuticas do secretoma coletado de MSCs expandidas em diferentes meios, pelo que se torna também necessário avaliar estas condicionantes relativamente às iMSCs. Desta forma, neste trabalho pretendeu-se: em primeiro lugar, desenvolver um modelo in vitro 3D e proceder à sua caracterização com vista ao seu emprego no estudo de PD; de seguida comparar a cultura a longo prazo de iMSCs em diferentes meios, correspondendo um a meio comercial sem soro e outro a meio suplementado com lisado de plaquetas humanas (hPL); posteriormente comparar os efeitos dos secretomas de iMSCs em diferentes passagens celulares e expandidas em diferentes meios na diferenciação dopaminérgica; e por fim comparar os efeitos destes secretomas na neuroprotecção de um modelo in vitro 3D onde foi induzida a degeneração dopaminérgica característica de PD. Um modelo in vitro 3D foi desenvolvido através da cultura de corpos embrioides orientada para a diferenciação dopaminérgica em hidrogéis de colagénio e posteriormente caracterizado qualitativamente e quantitativamente. Esta caracterização resultou na revelação de um modelo com a presença de uma rede neuronal robusta e com uma organização espacial 3D que mais se assemelha ao cérebro do que a organização refletida pela cultura celular 2D realizada. Uma porção das células obtidas foi identificada como neurónios dopaminérgicos (DA) maduros, o que revelou uma diferenciação bem-sucedida de células estaminais embrionárias de murganho (mESCs) em neurónios DA. Para além do uso de hidrogéis de colagénio, um scaffolds de origem natural, para o desenvolvimento deste modelo 3D, um outro scaffold alternativo, de origem sintética (baseado em Ormocomp), foi testado também. Os respetivos resultados sugeriram que ambos são capazes de suportar uma cultura celular 3D direcionada para a diferenciação dopaminérgica, apesar de o modelo 3D em colagénio ter tido uma capacidade superior para tal. A otimização da cultura 3D nestes dois scaffolds é, no entanto, necessária para futuros trabalhos experimentais, principalmente na cultura na estrutura baseada em Ormocomp. Devido à maior capacidade do modelo 3D em colagénio para originar neurónios dopaminérgicos, esse foi o modelo utilizado para posteriormente explorar os efeitos do secretoma coletado de iMSCs expandidas em diferentes meios e de diferentes passagens celulares. Os resultados obtidos acerca da cultura a longo prazo de iMSCs revelaram que as propriedades destas células podem ser moduladas através do uso de diferentes meios, tendo sido utilizados neste caso um meio comercial quimicamente definido e livre de componentes animais e um meio suplementado por hPL. A expansão de iMSCs em meio suplementado com hPL demonstrou uma maior capacidade proliferativa destas células e menores níveis de senescência na fase inicial da cultura assim como na fase final. A avaliação do perfil secretório das iMSCs expandidas nestes dois meios demonstrou a presença de proteínas com relevância terapêutica, incluindo, por exemplo, proteínas com atividade catalítica ou antioxidante, e proteínas relacionadas com a matriz extracelular (ECM) e interação célula-a-célula que podem ter funções na regeneração de tecidos e neuroprotecção. O perfil secretório analisado demonstrou-se, na maior parte, semelhante para as duas condições, sendo que apenas uma pequena parte das proteínas se encontrava significativamente diferencialmente expressa entre as duas condições. Algumas das proteínas detetadas como diferencialmente expressas estavam associadas à matriz extracelular com funções relacionadas com adesão celular e outras com a linhagem neuronal e neurogénese. A avaliação dos efeitos do secretoma de iMSCs expandidas em diferentes meios e de diferentes passagens celulares foi realizada recorrendo ao modelo 3D em colagénio. Esta revelou que secretoma de iMSCs de passagem inicial expandidas em meio suplementado com hPL é capaz de promover crescimento axonal e diferenciação dopaminérgica com sucesso, tendo os seus efeitos sido em parte similares aos promovidos pelo meio positivo de diferenciação dopaminérgica. Secretoma de iMSCs de passagem tardia expandidas em meio suplementado com hPL teve efeitos menos positivos nestes mesmos aspetos. Secretoma de iMSCs de passagem inicial expandidas em meio comercial de composição definida sem componentes animais também teve uma menor capacidade relativamente à promoção de diferenciação dopaminérgica. Estes resultados confirmam que não só o meio em que as iMSCs são expandidas, como também a passagem celular em que o secretoma é coletado, podem modular as propriedades terapêuticas destas células. A exposição do modelo 3D em colagénio a uma toxina, 6-OHDA, levou ao desenvolvimento de um modelo in vitro capaz de refletir a degeneração dopaminérgica presente em PD. Os efeitos do secretoma de iMSCs na neuroprotecção foram testados neste modelo de PD. Os resultados não demonstraram diferenças visíveis ou estatisticamente significativas na viabilidade da cultura entre o grupo veículo e o grupo sujeito à toxina. Em suma, estes resultados demonstram que as iMSCs podem ser moduladas por forma não só a aumentar o número de células passíveis de serem obtidas como também de forma a potenciar algumas das suas aplicações terapêuticas, como a sua capacidade de diferenciação dopaminérgica, relevando o seu potencial terapêutico em doenças como PD.
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Keywords
Células estaminais mesenquimais induzidas Meio de cultura celular Passagem celular Doença de parkinson Secretoma