Publicação
Epigenetic regulation of ZNF687 in bone cells: elucidation of its role in the progression of Paget’s disease of bone
| datacite.subject.fos | Ciências Médicas | |
| datacite.subject.sdg | 03:Saúde de Qualidade | |
| datacite.subject.sdg | 09:Indústria, Inovação e Infraestruturas | |
| datacite.subject.sdg | 17:Parcerias para a Implementação dos Objetivos | |
| dc.contributor.advisor | Cancela, Leonor | |
| dc.contributor.advisor | Conceição, Natércia | |
| dc.contributor.author | Domingos Varela, Débora Cristina | |
| dc.date.accessioned | 2026-03-13T14:32:34Z | |
| dc.date.available | 2026-03-13T14:32:34Z | |
| dc.date.issued | 2025-07-28 | |
| dc.description.abstract | Paget’s disease of bone (PDB) is characterized by focal areas of intense bone resorption by hyperactive osteoclasts followed by excessive bone formation by osteoblasts. Mutations and increased expression of ZNF687 have been associated with PDB. However, the role of ZNF687 in bone metabolism is poorly understood, and the molecular mechanisms that regulate its expression remain unknow. Therefore, the main objective of this study was to investigate the regulation of ZNF687 in bone cells, focusing on epigenetic mechanisms, in order to elucidate its involvement in the pathophysiology of PDB. In addition, we performed a genetic analysis of ZNF687, along with other candidate genes, in a cohort from southern Portugal. First, we characterized the human ZNF687 promoter, evaluated the functionality of predicted binding sites for bone-related transcription factors, and assessed the impact of CpG methylation on its regulatory activity. Our results indicate that NFκB, PU.1, DLX5, and SOX9 act as transcriptional regulators of ZNF687, and that DNA methylation inhibits their regulatory activity. Next, we analyzed mice Zfp687 expression and epigenetic regulation in MC3T3-E1 osteoblast differentiation and in hindlimb bones throughout mice life stages. Our results suggest that miR-142a-3p targets Zfp687 3′UTR, contributing to its downregulation during osteoblastogenesis, while DNA methylation does not appear to regulate Zfp687. In the PDB genetic study of Portuguese population, we identified the ZNF687 c.2810C>A variant that was predicted in silico to be pathogenic and shown in vitro to enhance nuclear import. In addition, OPTN rs2234968 variant was significantly associated with PDB. Finally, we examined ZNF687 expression and CpG methylation during in vitro osteoclast differentiation. ZNF687 was upregulated during murine osteoclastogenesis and overexpressed in osteoclasts from PDB patients in comparison to those of healthy controls. Moreover, methylation levels in -506/-396 promoter region were significantly higher in osteoclasts from PDB patients compared to their undifferentiated precursors and healthy osteoclasts. In summary, this work evidences the involvement of epigenetic mechanisms in bone cells’ differentiation, particularly in the regulation of the ZNF687 gene during osteoclast and osteoblast differentiation. Furthermore, it suggests that DNA methylation may contribute to the upregulation of ZNF687 in PDB. | eng |
| dc.description.abstract | A doença óssea de Paget (DOP) apresenta uma prevalência entre 1,5% a 8,3%, sendo considerada a segunda doença metabólica óssea mais frequente, logo a seguir à osteoporose. É uma condição crónica caracterizada por áreas focais de intensa reabsorção óssea, causada por numerosos osteoclastos gigantes e hiperativos, seguida de formação óssea aberrante e excessiva mediada por osteoblastos. Como resultado, os ossos afetados pela DOP apresentam uma estrutura desorganizada, aumentada e deformada, ficando mais suscetíveis a fraturas. A etiologia da DOP ainda não está totalmente compreendida, no entanto fatores genéticos, ambientais e epigenéticos têm sido implicados na sua fisiopatologia. O envolvimento de uma componente genética no desenvolvimento desta doença é fortemente apoiado pela existência de história familiar em até 40% dos doentes com DOP e pela evidência de transmissão autossómica dominante. Além disso, vários loci de suscetibilidade e genes associados à DOP foram identificados por meio de análises de desequilíbrio de ligação e estudos de associação do genoma completo (GWAS). A maioria destes genes, incluindo o SQSTM1, TNFRSF11A, OPTN e CSF1, desempenham papéis cruciais na diferenciação e função dos osteoclastos. Mais recentemente, o gene ZNF687, foi também identificado como causador da DOP, tendo sido inicialmente detetado através da sequenciação do exoma completo numa família italiana. As mutações identificadas no gene ZNF687, especialmente a mutação c.2810C>G, resultam numa forma mais grave da doença, caracterizada por um início precoce e um aumento do número de ossos afetados, que em menos de 1% dos casos é acompanhado por tumores de células gigantes. O gene ZNF687 codifica uma proteína de dedo de zinco do tipo C2H2 com um potencial domínio de ligação ao ADN, no entanto, o seu papel no metabolismo ósseo permanece pouco compreendido. Estudos realizados in vitro e in vivo mostraram que a proteína ZNF687 tem funções regulatórias no metabolismo ósseo, uma vez que se verificou que o gene é regulado positivamente durante a diferenciação de osteoblastos e osteoclastos e sobre-expresso nas células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de doentes com DOP. No entanto, os mecanismos moleculares que regulam a expressão do ZNF687 não são conhecidos. Avanços relevantes estão a ser feitos na investigação epigenética em células ósseas, comprovando que existem alterações nos miRNAs, histonas e padrões de metilação do ADN ao longo dos processos de diferenciação e maturação das células, indicando um envolvimento significativo na remodelação óssea. Distúrbios na regulação transcricional e epigenética afetam a função e atividade das células ósseas, contribuindo consequentemente para o desenvolvimento de doenças ósseas. Assim sendo, o principal objetivo deste trabalho foi estudar a regulação do ZNF687 em células ósseas, com foco na regulação epigenética, para elucidar o seu papel na fisiopatologia da DOP. Além disso, uma vez que atualmente não são conhecidas associações genéticas à DOP na população portuguesa, propusemo-nos também realizar uma investigação genética num grupo de indivíduos da região sul de Portugal. Em primeiro lugar, caracterizámos as regiões promotoras do gene humano ZNF687 e analisámos a funcionalidade dos locais de ligação identificados putativamente para fatores de transcrição relacionados com o osso, assim como o efeito da metilação na transcrição do ZNF687. A análise bioinformática revelou uma elevada densidade de ilhas CpG nas regiões promotoras e a metilação realizada in vitro reduziu drasticamente a atividade dos promotores. Vários sítios de ligação putativos, contendo dinucleótidos CpG, para os fatores de transcrição NFκB, PU.1, DLX5 e SOX9, foram identificados nas regiões promotoras do ZNF687. Através de ensaios da atividade de luciferase em células HEK293 e hFOB1.19, verificámos que o fator de transcrição DLX5 ativou especificamente a região promotora 1 do ZNF687, o NFκB reprimiu e ativou as regiões promotoras 1 e 2, respetivamente, o PU.1 induziu a região promotora 1 e o SOX9 também regulou ambas as regiões promotoras do ZNF687. Porém, a metilação in vitro das regiões promotoras afetou a capacidade de regulação por parte destes fatores de transcrição. Estes resultados indicam que o NFκB, PU.1, DLX5 e SOX9 são reguladores transcricionais do gene ZNF687, e que a metilação do ADN impede a ligação e funcionalidade dos mesmos. Em segundo lugar, analisámos o perfil de expressão do gene ZNF687 de ratinho (Zfp687) e a sua regulação epigenética durante a diferenciação osteoblástica das células MC3T3-E1 e em ossos dos membros posteriores de ratinhos C57BL/6J em várias fases de desenvolvimento, crescimento e envelhecimento. Os resultados obtidos mostraram que a expressão do Zfp687, tanto ao nível do mRNA como da proteína, diminuiu durante a diferenciação dos osteoblastos. Relativamente aos ossos dos ratinhos, observou-se uma diminuição na expressão da maioria dos genes associados à formação óssea desde a juventude até à idade adulta. Por outro lado, a expressão dos genes Zfp687 e Runx2 não sofreu alterações neste período, sendo apenas reduzida significativamente nos ratinhos idosos. A análise por sequenciação de bissulfito revelou que durante ambos os processos, o promotor do Zfp687 encontra-se hipometilado e não foram observadas alterações significativas. Além disso, através da análise bioinformática identificou-se sítios de ligação para o miR-142a-3p, miR-122b-5p e miR-124-3p na região 3′UTR do gene Zfp687 e, através de RT-qPCR, observou-se uma maior expressão destes miRNAs nos osteoblastos maduros em comparação com os seus precursores indiferenciados. A transfeção de um imitador do miR-142-3p levou à redução da atividade da luciferase do 3’UTR do Zfp687 do tipo selvagem, mas não a do 3’UTR mutado. Assim como levou à diminuição da expressão endógena do ZNF687 tanto ao nível do mRNA como da proteína nas células MC3T3-E1 e hFOB1.19. Estes resultados sugerem que o miR-142a-3p liga-se diretamente ao 3′UTR do ZNF687, promovendo a sua regulação negativa durante a osteoblastogénese, enquanto a metilação do ADN não parece regular o Zfp687 durante a diferenciação dos osteoblastos ou o desenvolvimento ósseo em ratinhos. Além disso, uma vez que tivemos acesso a indivíduos com DOP através de uma colaboração com o serviço de reumatologia do Hospital de Faro (ULS Algarve), realizámos também um estudo demográfico e genético numa coorte do sul de Portugal constituída por 32 doentes e 51 controlos saudáveis da mesma idade. A nossa análise revelou uma predominância significativa da DOP no sexo masculino, uma maior incidência de PDB entre os 70 e os 79 anos, sendo a pélvis o local mais afetado. A mutação mais comummente reportada na DOP, a substituição c. 1175C>T no gene SQSTM1, foi detetada em dois dos doentes estudados. E a mutação c.2810C>A (p.Pro937His) no gene ZNF687 foi identificada num doente, que através de análise in silico se previu como sendo provavelmente patogénica e através de experiências in vitro como potenciadora da importação nuclear. Além disso, os nossos resultados mostraram que a variante rs2234968 no gene OPTN está significativamente associada à PDB, na população portuguesa. Por fim, analisámos a expressão do gene ZNF687 durante a diferenciação osteoclástica in vitro em células de ratinho Raw264.7 e de PBMCs humanas. Assim como, analisámos as alterações nos níveis de metilação de CpG do promotor do ZNF687 após a indução de osteoclastogénese de PBMCs de indivíduos saudáveis e de doentes com DOP. Os nossos resultados mostraram que a expressão do ZNF687 é regulada positivamente durante a diferenciação dos osteoclastos de ratinho e sobre-expressa nos osteoclastos de doentes com DOP, em comparação com os dos controlos saudáveis. Através da análise de sequenciação de bissulfito, observou-se um nível de metilação de CpGs significativamente maior na região promotora do ZNF687 (na posição -506 a -396 em relação ao início da transcrição), nos osteoclastos de doentes com DOP em comparação com as células precursoras indiferenciados e com osteoclastos saudáveis. Estes resultados sugerem que, em contexto de DOP, os padrões de metilação do ADN do ZNF687 são alterados durante a osteoclastogénese, contribuindo potencialmente para a desregulação do ZNF687 e, consequentemente, para a patogénese da DOP. Em suma, este trabalho evidencia o envolvimento e a importância da epigenética no processo de diferenciação das células ósseas, particularmente na regulação do gene ZNF687 durante a diferenciação dos osteoclastos e osteoblastos. Além disso, fornece novos conhecimentos sobre os fatores de transcrição que regulam o gene ZNF687 e sugere a metilação do ADN como um possível mecanismo que contribuí para a regulação positiva do ZNF687 na DOP. | por |
| dc.identifier.tid | 101826354 | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10400.1/28421 | |
| dc.language.iso | eng | |
| dc.relation | Epigenetic regulation of ZNF687 in bone cells: elucidation of its role in the progression of Paget’s disease towards giant cell tumor of bone | |
| dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ | |
| dc.subject | znf687 | |
| dc.subject | Paget’s disease of bone | |
| dc.subject | Epigenetics: dna methylation | |
| dc.subject | Mirnas | |
| dc.title | Epigenetic regulation of ZNF687 in bone cells: elucidation of its role in the progression of Paget’s disease of bone | por |
| dc.type | doctoral thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| oaire.awardNumber | SFRH/BD/141918/2018 | |
| oaire.awardTitle | Epigenetic regulation of ZNF687 in bone cells: elucidation of its role in the progression of Paget’s disease towards giant cell tumor of bone | |
| oaire.awardURI | info:eu-repo/grantAgreement/FCT//SFRH%2FBD%2F141918%2F2018/PT | |
| person.familyName | Domingos Varela | |
| person.givenName | Débora Cristina | |
| person.identifier.ciencia-id | 9A1C-DFE4-98C9 | |
| project.funder.identifier | http://doi.org/10.13039/501100001871 | |
| project.funder.name | Fundação para a Ciência e a Tecnologia | |
| relation.isAuthorOfPublication | a9ec3c7d-f5ad-4629-94b9-627d6212f926 | |
| relation.isAuthorOfPublication.latestForDiscovery | a9ec3c7d-f5ad-4629-94b9-627d6212f926 | |
| relation.isProjectOfPublication | 7baff70a-818d-4310-8373-6b29231dc0c3 | |
| relation.isProjectOfPublication.latestForDiscovery | 7baff70a-818d-4310-8373-6b29231dc0c3 | |
| thesis.degree.grantor | Universidade do Algarve. Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina | |
| thesis.degree.level | Doutor | |
| thesis.degree.name | Doutoramentom em Ciências Biomédicas |