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Publication
Study of RNA-binding protein networks in colorectal cancer cells
| Name: | Description: | Size: | Format: | |
|---|---|---|---|---|
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Authors
Abstract(s)
Colorectal cancer (CRC) is one of the leading cancer-related deaths in the world,
causing the death of almost 1 million people every year, thus highlighting the need for
better prognostic biomarkers and reliable therapeutic targets. It is increasingly evident
that RBPs are major players in stem cell biology and carcinogenesis, namely in CRC, and
have the potential to regulate several cancer-related phenotypes when dysregulates.
Therefore, we aimed at identifying new RBPs with a functional impact in the context of
CRC.
An in silico approach led us to three potential stemness-related RBPs: ASPM,
TIMELESS and ZBTB16. The characterization of a cohort of human CRC cases showed
that ASPM and ZBTB16 were preferentially overexpressed in tumoral tissue, whereas
TIMELESS was expressed at low and high levels in the same proportion of cases.
However, an association with a MSS status was found, indicating that TIMELESS might
have a predictive prognostic value.
TIMELESS knockdown induced several functional changes in CRC cell lines,
some in a cell line-specific manner. TIMELESS depletion led to a prominent reduction
of cells in S phase and sensitized them for apoptosis or necrosis which was further
amplified by the exposure to the chemotherapeutic agent 5-FU. Furthermore, we observed
that TIMELESS expression was restricted to the crypt base in normal tissue and the
expression of several known ISC markers was altered upon TIMELESS removal. The
phenotypic alterations also occurred at the level of mRNA metabolism in SW480 cells
through a reduction of P-body aggregates.
Our results show that TIMELESS might be implicated in key tumorigenic
processes, such as promotion of cell proliferation and cell death avoidance. This work
highlights the relevance of putative RBPs in CRC and the understanding of their
functional impact opens an avenue for novel cancer therapies.
O epitélio intestinal é o tecido que mais rapidamente se regenera em mamíferos, sendo renovado a cada 3-5 dias. Esta incrível capacidade é assegura por células estaminais localizadas no fundo das criptas intestinais identificadas pela expressão de Lgr5, um gene alvo da via de sinalização Wnt. Porém, as células Lgr5+ já foram identificadas como as células de origem do cancro colorectal (CCR), sendo fundamentais não só para o seu crescimento como também para a sua disseminação e resistência a quimioterapia. O CCR é atualmente a segunda causa de morte por cancro em Portugal e no mundo, tendo causado cerca de 940.000 mortes em 2020. A sua incidência está principalmente associada a estilos de vida típicos de países desenvolvidos que compreendem 60% das mortes. A etiologia e os mecanismos moleculares responsáveis tanto pelo aparecimento como pela progressão da doença já foram extensamente estudados ao longo das últimas décadas. Contudo, maioria dos pacientes apresenta doença metastática, sobretudo no fígado, na altura do diagnóstico e a remoção cirúrgica do tumor continua a ser a melhor opção de tratamento, o que a que a sobrevida a 5 anos em pacientes em estadio avançado ronde os 10%. Isto demonstra a falta de melhores biomarcadores com valor prognóstico e do desenvolvimento de terapias mais eficazes. Os mecanismos de regulação pós-transcricionais têm um papel fundamental na expressão génica, os quais são sobretudos mediados por proteínas de ligação ao ARN. Estas representam alvos terapeuticamente interessantes tendo em conta que são capazes de regular a expressão de múltiplas proteínas relevantes para o processo cancerígeno. A desregulação das proteínas de ligação ao ARN tem sido associados à biologia das células estaminais e à carcinogénese, nomeadamente no CCR. Desta forma, o nosso trabalho tem como objetivo a identificação de novas proteínas de ligação ao ARN relacionadas com o potencial estaminal e que desempenhem funções relevantes em células de CCR. Partindo de uma abordagem bioinformática selecionámos três candidatos associados a estaminalidade e diferencialmente expressos em casos de CCR: ASPM, TIMELESS e ZBTB16. A caraterização de uma série de 192 casos de CCR revelou que ASPM e ZBTB16 estão preferencialmente sobreexpressos em tumores, enquanto que TIMELESS estava expresso em baixos e altos níveis na mesma proporção de casos. Além disso, procurámos ainda associar os dados de expressão com as características clinino patológicas dos pacientes que revelaram uma correlação estatisticamente significativa da elevada expressão de ASPM e TIMELESS com estabilidade de microssatélites tipicamente associada a um pior prognóstico. De seguida, e tendo em conta as observações anteriores e a disponibilidade de ferramentas molecular, prosseguimos o estudo do papel de TIMELESS na biologia do CCR. Considerando o papel central da via de sinalização Wnt nas células estaminais e no desenvolvimento de CCR, começámos por tentar esclarecer se TIMELESS é regulado pela via Wnt em cultura de organóides intestinais de ratinho. De facto, a estimulação da via Wnt levou a um aumento na expressão de TIMELESS, embora não expressiva a nível de ARNm, sugerindo que TIMELESS poderá não ser um alvo da via Wnt mas sim estar associado à expansão da população de células Lgr5+ induzida pela ativação da via. A inibição de TIMELESS por siARN produziu várias alterações a nível funcional nas linhas celulares de CCR HCT116 e SW480. A depleção de TIMELESS afetou a progressão das células no ciclo celular, aumentando as células nas fases G1 e G2/M, e diminuindo a fase S. Além disso, a remoção de TIMELESS também afetou a morte celular embora de forma distinta nas duas linhas celular. Nas células HCT116, a inibição de TIMELESS induziu a morte por apoptose, mas a combinação com o agente quimioterapêutico 5-FU potenciou a necrose. Por outro lado, a ausência de TIMELESS nas células SW480 causou principalmente morte por necrose, enquanto a adição de 5-FU teve um efeito considerável no aumento de células em apoptose. Este efeito específico das linhas celulares dever-se-á provavelmente ao seu perfil mutacional, pois as células HCT116 não apresentam p53 defeituoso, sendo, por isso, mais capazes de desencadear a morte celular programada, ao contrário das células SW480 que são mutantes em p53. Coletivamente, estas observações sugerem que a expressão de TIMELESS promove a proliferação celular ao prevenir a paragem do ciclo celular e está envolvida na manutenção da viabilidade celular ao evitar mecanismos de morte celular incluindo na presença de stress genotóxico. No entanto, e contrariamente ao que já havia sido publicado, não conseguimos associar TIMELESS à capacidade migratória de células de CCR, possivelmente devido ao facto da transfeção transiente não produzir alterações significativas no fenótipo celular visíveis por 24h. Além disso, a depleção de TIMELESS resultou ainda num aumento a expressão de alguns marcadores de células estaminais intestinais, contradizendo os resultados anteriores. Isto poderá indicar um possível mecanismo compensatório para as alterações causadas pela depleção de TIMELESS. Alterações essas que se estendem ao metabolismo de ARNm, pelo menos nas células SW480, visto que a ausência de TIMELESS afetou a dinâmicas dos corpos P, isto é, agregados citoplasmáticos de ARNm cuja tradução foi reprimida. Apesar do número de agregados se manter constante na inibição de TIMELESS, verificámos uma diminuição na área destes agregados que se refletiu também numa menor intensidade de fluorescência. Considerando os resultados obtidos, concluímos que TIMELESS está efetivamente implicado na biologia do CCR, estando envolvido tanto na proliferação como nos mecanismos de morte celular e estaminalidade. Trabalhos futuros serão necessários para determinar os mecanismos moleculares por detrás destes processos em CCR bem como esclarecer o seu papel na homeostasia do epitélio intestinal e mais concretamente nas células Lgr5+. Além disso, também demonstrámos que ASPM e ZBTB16 estão preferencialmente sobreexpressos em tumores humanos. Desta forma, ao determinar o envolvimento destas três proteínas em mecanismos de regulação póstranscricional, permitirá uma melhor compreensão e enquadramento dos mecanismos subjacentes ao desenvolvimento e progressão do CCR, que permanece uma das principais causas de mortes mundialmente. Assim, o presente trabalho permitiu identificar três novas potenciais proteínas de ligação ao ARNm, tendo uma delas, TIMELESS, sido demonstrada a sua relevância a nível funcional, o que abre novas perspetivas para novos biomarcadores e potenciais terapias para o CCR.
O epitélio intestinal é o tecido que mais rapidamente se regenera em mamíferos, sendo renovado a cada 3-5 dias. Esta incrível capacidade é assegura por células estaminais localizadas no fundo das criptas intestinais identificadas pela expressão de Lgr5, um gene alvo da via de sinalização Wnt. Porém, as células Lgr5+ já foram identificadas como as células de origem do cancro colorectal (CCR), sendo fundamentais não só para o seu crescimento como também para a sua disseminação e resistência a quimioterapia. O CCR é atualmente a segunda causa de morte por cancro em Portugal e no mundo, tendo causado cerca de 940.000 mortes em 2020. A sua incidência está principalmente associada a estilos de vida típicos de países desenvolvidos que compreendem 60% das mortes. A etiologia e os mecanismos moleculares responsáveis tanto pelo aparecimento como pela progressão da doença já foram extensamente estudados ao longo das últimas décadas. Contudo, maioria dos pacientes apresenta doença metastática, sobretudo no fígado, na altura do diagnóstico e a remoção cirúrgica do tumor continua a ser a melhor opção de tratamento, o que a que a sobrevida a 5 anos em pacientes em estadio avançado ronde os 10%. Isto demonstra a falta de melhores biomarcadores com valor prognóstico e do desenvolvimento de terapias mais eficazes. Os mecanismos de regulação pós-transcricionais têm um papel fundamental na expressão génica, os quais são sobretudos mediados por proteínas de ligação ao ARN. Estas representam alvos terapeuticamente interessantes tendo em conta que são capazes de regular a expressão de múltiplas proteínas relevantes para o processo cancerígeno. A desregulação das proteínas de ligação ao ARN tem sido associados à biologia das células estaminais e à carcinogénese, nomeadamente no CCR. Desta forma, o nosso trabalho tem como objetivo a identificação de novas proteínas de ligação ao ARN relacionadas com o potencial estaminal e que desempenhem funções relevantes em células de CCR. Partindo de uma abordagem bioinformática selecionámos três candidatos associados a estaminalidade e diferencialmente expressos em casos de CCR: ASPM, TIMELESS e ZBTB16. A caraterização de uma série de 192 casos de CCR revelou que ASPM e ZBTB16 estão preferencialmente sobreexpressos em tumores, enquanto que TIMELESS estava expresso em baixos e altos níveis na mesma proporção de casos. Além disso, procurámos ainda associar os dados de expressão com as características clinino patológicas dos pacientes que revelaram uma correlação estatisticamente significativa da elevada expressão de ASPM e TIMELESS com estabilidade de microssatélites tipicamente associada a um pior prognóstico. De seguida, e tendo em conta as observações anteriores e a disponibilidade de ferramentas molecular, prosseguimos o estudo do papel de TIMELESS na biologia do CCR. Considerando o papel central da via de sinalização Wnt nas células estaminais e no desenvolvimento de CCR, começámos por tentar esclarecer se TIMELESS é regulado pela via Wnt em cultura de organóides intestinais de ratinho. De facto, a estimulação da via Wnt levou a um aumento na expressão de TIMELESS, embora não expressiva a nível de ARNm, sugerindo que TIMELESS poderá não ser um alvo da via Wnt mas sim estar associado à expansão da população de células Lgr5+ induzida pela ativação da via. A inibição de TIMELESS por siARN produziu várias alterações a nível funcional nas linhas celulares de CCR HCT116 e SW480. A depleção de TIMELESS afetou a progressão das células no ciclo celular, aumentando as células nas fases G1 e G2/M, e diminuindo a fase S. Além disso, a remoção de TIMELESS também afetou a morte celular embora de forma distinta nas duas linhas celular. Nas células HCT116, a inibição de TIMELESS induziu a morte por apoptose, mas a combinação com o agente quimioterapêutico 5-FU potenciou a necrose. Por outro lado, a ausência de TIMELESS nas células SW480 causou principalmente morte por necrose, enquanto a adição de 5-FU teve um efeito considerável no aumento de células em apoptose. Este efeito específico das linhas celulares dever-se-á provavelmente ao seu perfil mutacional, pois as células HCT116 não apresentam p53 defeituoso, sendo, por isso, mais capazes de desencadear a morte celular programada, ao contrário das células SW480 que são mutantes em p53. Coletivamente, estas observações sugerem que a expressão de TIMELESS promove a proliferação celular ao prevenir a paragem do ciclo celular e está envolvida na manutenção da viabilidade celular ao evitar mecanismos de morte celular incluindo na presença de stress genotóxico. No entanto, e contrariamente ao que já havia sido publicado, não conseguimos associar TIMELESS à capacidade migratória de células de CCR, possivelmente devido ao facto da transfeção transiente não produzir alterações significativas no fenótipo celular visíveis por 24h. Além disso, a depleção de TIMELESS resultou ainda num aumento a expressão de alguns marcadores de células estaminais intestinais, contradizendo os resultados anteriores. Isto poderá indicar um possível mecanismo compensatório para as alterações causadas pela depleção de TIMELESS. Alterações essas que se estendem ao metabolismo de ARNm, pelo menos nas células SW480, visto que a ausência de TIMELESS afetou a dinâmicas dos corpos P, isto é, agregados citoplasmáticos de ARNm cuja tradução foi reprimida. Apesar do número de agregados se manter constante na inibição de TIMELESS, verificámos uma diminuição na área destes agregados que se refletiu também numa menor intensidade de fluorescência. Considerando os resultados obtidos, concluímos que TIMELESS está efetivamente implicado na biologia do CCR, estando envolvido tanto na proliferação como nos mecanismos de morte celular e estaminalidade. Trabalhos futuros serão necessários para determinar os mecanismos moleculares por detrás destes processos em CCR bem como esclarecer o seu papel na homeostasia do epitélio intestinal e mais concretamente nas células Lgr5+. Além disso, também demonstrámos que ASPM e ZBTB16 estão preferencialmente sobreexpressos em tumores humanos. Desta forma, ao determinar o envolvimento destas três proteínas em mecanismos de regulação póstranscricional, permitirá uma melhor compreensão e enquadramento dos mecanismos subjacentes ao desenvolvimento e progressão do CCR, que permanece uma das principais causas de mortes mundialmente. Assim, o presente trabalho permitiu identificar três novas potenciais proteínas de ligação ao ARNm, tendo uma delas, TIMELESS, sido demonstrada a sua relevância a nível funcional, o que abre novas perspetivas para novos biomarcadores e potenciais terapias para o CCR.
Description
Keywords
Colorectal cancer RNA-binding protein Intestinal stem cells TIMELESS ASPM ZBTB16