Publication
Effect of marine-derived extracts on mineralogenesis
| datacite.subject.fos | Ciências Médicas::Outras Ciências Médicas | pt_PT |
| dc.contributor.advisor | Cancela, Leonor | |
| dc.contributor.advisor | Gavaia, Paulo | |
| dc.contributor.author | Carletti, Alessio | |
| dc.date.accessioned | 2023-10-18T10:04:18Z | |
| dc.date.embargo | 2024-10-18 | |
| dc.date.issued | 2023-05-30 | |
| dc.description.abstract | Bone erosive pathologies are the leading cause of fractures worldwide and represent a pressing medical and economic burden. Diseases like osteoporosis, Paget’s disease of bone, hyperparathyroidism, and renal osteodystrophy, have different pathophysiological roots but they all share a common feature: they lead to loss of bone mineral and result into increased bone fragility. This class of disorders are also a compelling pharmaceutical challenge. Currently, there is a limited choice of therapeutic agents available to treat bone loss and they are often characterized by short-timed efficacy and severe side effects. Meanwhile, fish grown in aquaculture, the primary source of seafood for human consumption, typically suffer from skeletal abnormalities that are universally present in all culture conditions and fish species. These skeletal defects appear to be largely caused by factors intrinsically related to the condition of captivity, including the lack of an adequate nutrition. The EU-funded Marie-Curie ITN project BIOMEDAQU, in the scope of which this PhD project is framed, provided a multidisciplinary platform bringing together research in biomedicine and aquaculture (from which Biomed-Aqu) with the objective of creating new knowledge with applications in both research fields. In this context, marine-based pharmacology, the branch of pharmaceutical research focalized on the screening and characterization of marine natural compounds, can contribute to fulfill knowledge gaps and provide translational applications for both disciplines. Different groups of marine organisms have been studied as sources of “osteoactive” compounds, some of which were described for their highly promising pharmacological and nutraceutical potential. The objective of this PhD project was to screen and characterize extracts obtained from various groups of marine organisms, selected as candidates for the isolation of compounds with potential applications for the biomedical sector, in the development of drugs to treat human bone erosive pathologies, and for the aquaculture industry, to be used as nutraceuticals to be incorporated into fish feeds to ameliorate skeletal health. With this aim, we put in place a medium-scale screening project evaluating about 150 extracts and fractions obtained from different marine organisms that recent pharmacological research has identified as promising sources of bioactive compounds, including holothurians, tunicates, cyanobacteria, marine bacteria, and microalgae. As a result of this screening activity, we identified ethanolic extracts from two microalgal species, Skeletonema costatum and Tetraselmis striata (CTP4 strain), as the most promising for their pro-osteogenic activities. Then, we further characterized them by testing using in vitro bone-derived cellular models, and in vivo, in the model organism zebrafish (Danio rerio), used as platform to investigate more in-depth the molecular mechanism of actions of the two extracts. By doing this, we revealed that the ethanolic extract from the microalga Tetraselmis striata CTP4 possessed the strongest osteoanabolic properties. We then wanted to provide a proof of concept of possible applications of these two extracts in the aquaculture industry by exploring their potential to be used as dietary supplements for the commercially reared species Sparus aurata. Accordingly, we found that Tetraselmis striata CTP4 is the most promising extract in this sense, in light of its capacity to promote fish growth, bone mineralization, and reduce the incidence of skeletal anomalies in seabream juveniles. Finally, we decided to dissect the molecular mechanism behind the osteoactivity of the ethanolic extracts from Skeletonema costatum, and validate its potential application for the treatment of bone erosive disorders in human patients. We found that the extract has mainly an anti-osteoclastogenic activity, and we put it in the prospect of its previously known antiinflammatory potential. We also provide evidence that its application can limit bone loss in a medaka model of osteoporosis, and that its anti-osteoclastogenic properties are conserved in a mammalian in vitro cell model. Overall, through this PhD project, by identifying and characterizing these two microalgae extracts in the context of bone mineralization, we have provided the substrate for future research aimed at isolating compounds with potential applications in human medicine and as dietary supplements for aquaculture nutrition. | pt_PT |
| dc.description.abstract | As patologias erosivas do ósseo são a principal causa de fraturas em todo o mundo e representam um fardo médico e económico com grande impacto financeiro. Doenças como osteoporose, doença de Paget, hiperparatiroidismo e osteodistrofia renal têm diferentes causas fisiopatológicas, mas todos eles partilham uma característica comum: levam à perda de minerais e resultam em maior fragilidade óssea. Essa classe de distúrbios também apresenta um desafio farmacêutico. A escolha muito limitada de opções terapêuticas atualmente disponíveis para tratar distúrbios associados à fragilidade óssea é frequentemente caracterizada por eficácia de curto prazo e efeitos colaterais graves. Por outro lado, peixes provenientes de aquacultura, a principal fonte de recursos marinhos para consumo humano, geralmente sofrem de anomalias esqueléticas que estão universalmente presentes em todas as condições de cultivo e espécies de peixes. Esses defeitos esqueléticos parecem ser em grande parte causados por fatores intrinsecamente relacionados à condição de cativeiro, incluindo a falta de nutrição adequada. O projeto Marie-Curie ITN BIOMEDAQU, financiado pela UE, no âmbito do qual este projeto de doutoramento se enquadra, forneceu uma plataforma multidisciplinar reunindo investigação em biomedicina e aquacultura com o objetivo de criar novos conhecimentos com aplicações em ambas as áreas de investigação. Nesse contexto, a farmacologia de base marinha, ramo da investigação farmacêutica focada na triagem e caracterização de compostos naturais marinhos, pode contribuir para preencher lacunas de conhecimento em ambas as disciplinas. No Capítulo 1, cuja primeira seção está atualmente submetida para publicação, revemos e listamos todos os compostos osteoativos marinhos identificados até o momento. Também discutimos as distribuições taxonómicas de tais compostos e identificamos os grupos de organismos marinhos que parecem promissores para investigações futuras direcionadas para a descoberta de novos fármacos para tratamento de distúrbios ósseos metabólicos. Examinamos também, ainda que brevemente, a disponibilidade de ferramentas de triagem e validação in vivo para o estudo de compostos osteoativos de origem marinha. Além disso, também revemos os aspetos nutricionais relacionados com o desenvolvimento de anomalias esqueléticas em peixes de aquacultura e o potencial da suplementação dietética de extratos naturais marinhos ricos em compostos com efeitos promotores da saúde do esqueleto como uma estratégia de custobenefício para reduzir distúrbios esqueléticos em peixes de cultivo. Na seção final do capítulo, discutimos brevemente as diferentes abordagens que são atualmente aplicadas na bioprospecção ambiental na procura de potenciais moléculas com efeitos terapêuticos e nutracêuticos, qual o papel que as instituições académicas desempenham na investigação farmacêutica e terminamos com a descrição dos objetivos específicos propostos para esta tese de doutoramento No Capítulo 2, implementamos um projeto de triagem de média escala focado na procura de extratos de vários grupos de organismos marinhos com alto potencial biotecnológico para o isolamento de compostos bioativos. Esses extratos foram depois testados no modelo de peixezebra (Danio rerio). Bem estabelecido pela sua contribuição para o estudo de patologias do esqueleto devido aos mecanismos de doença altamente conservados e vantagens técnicas sobre modelos tradicionais de roedores, o peixe-zebra é um modelo de escolha para grandes ensaios de triagem fenotípica in vivo visando identificar compostos com potencial osteogénico. Assim, na primeira seção do capítulo, que foi publicada na revista Frontiers in Nutrition (ver Capítulo 2.1), exploramos o potencial bioativo de 14 extratos obtidos de várias espécies de invertebrados marinhos pertencentes aos grupos de pepinos do mar e tunicados, como fontes de compostos antioxidantes, anti-inflamatórios e osteogénicos. Identificamos três extratos etanólicos caracterizados por uma forte atividade osteogénica in vivo, que se correlacionou positivamente com o seu potencial anti-inflamatório. Na segunda seção do capítulo (em preparação para submissão até ao fim do primeiro semestre de 2023), realizamos uma atividade de triagem em 133 extratos e frações preparados a partir de vários microrganismos marinhos, incluindo cianobactérias, actinobactérias, planctomicetos e microalgas. Como resultado, identificamos 4 extratos etanólicos de espécies de microalgas marinhas com potente atividade pró-osteogénica. No Capítulo 3, após a triagem realizada no capítulo anterior, o extrato etanólico de Tetraselmis striata CTP4 (CTP4) foi selecionado como o melhor candidato para realizar a caracterização química devido à ausência de toxicidade em todas as concentrações testadas no peixe zebra, e à disponibilidade do produtor e parceiro industrial (Necton SA, Olhão, Portugal) para produzir grandes quantidades de biomassa da microalga utilizada para preparar o extrato. Consequentemente, o extrato CTP4 foi processado por meio de um pipeline de identificação guiado por bioensaio com o objetivo de identificar compostos potencialmente responsáveis pelo efeito osteogénico positivo observado em larvas de peixe-zebra. O extrato foi fracionado por cromatografia líquida de alta eficiência, produzindo 15 frações cuja bioatividade foi testada individualmente. Destas, 8 frações apresentaram efeito osteogénico e em concentrações menores quando comparadas às utilizadas com o extrato bruto, indicando que os compostos responsáveis pela ação osteogénica foram enriquecidos após o fracionamento. Duas frações foram selecionadas e processadas por meio de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas, que evidenciou a complexa composição química das frações, ao revelar a presença de mais de 8000 compostos. A seleção desses compostos foi realizada aplicando critérios baseados na abundância relativa dentro das duas frações mais bioativas em comparação com as menos bioativas. Como resultado, 15 compostos foram identificados como possíveis candidatos e 7 destes, disponíveis comercialmente, foram adquiridos e avaliados quanto ao potencial osteogénico com o teste do opérculo, mas nenhum deles demonstrou possuir um efeito positivo. Fontes potenciais de variação e identificação incorreta de compostos são discutidas no final do capítulo, bem como possíveis estratégias futuras a serem aplicadas para superar essas limitações. No Capítulo 4, atualmente submetido à revista Biomolecules (MDPI), caracterizamos ainda o efeito biológico dos dois melhores extratos selecionados no Capítulo 2, das espécies de microalgas Skeletonema costatum e Tetraselmis striata CTP4. Foram analisados num sistema in vitro derivado de células ósseas de dourada, tendo demonstrado um efeito positivo nos níveis da matriz extracelular (ECM). Ao aplicar linhagens transgénicas de peixe-zebra que marcam diferentes estádios de diferenciação osteoblástica, também descobrimos que elas estimulam a diferenciação osteoblástica e regulam genes envolvidos na formação e mineralização óssea. Ao expor larvas de peixe-zebra aos extratos por suplementação alimentar de longo prazo, confirmamos que ambos, e em particular T. striata CTP4, estimulam a mineralização de todos os elementos esqueléticos no peixe-zebra, atuando de maneira osteoanabólicas e também sendo capazes de reduzir a incidência de anomalias esqueléticas. No Capítulo 5 (cujo manuscrito está em preparação, e pretendemos submetê-lo à Aquaculture), validamos o uso dos dois extratos de microalgas na indústria da aquacultura, testando-os como suplementos alimentares para a espécie de dourada (Sparus aurata). As dietas suplementadas com ambos os extratos, foram testadas em diferentes estádios de vida da dourada, incluindo larvas de 30-60 dias após a eclosão (DAH) e juvenis durante a fase de crescimento (5-18g). Além disso, alguns peixes juvenis foram mantidos por mais 6 meses enquanto alimentados com dietas comerciais, a fim de avaliar se o tratamento curto com extratos de microalgas poderia afetar o estado do esqueleto dos peixes até mais tarde no seu crescimento. No geral, descobrimos que a suplementação com extratos de microalgas não afetou a incidência de anomalias esqueléticas em estádios larvais, embora tenham sido capazes de estimular mecanismos moleculares envolvidos no crescimento ósseo e mecanismos antioxidantes. Nos estádios juvenis, no entanto, a suplementação com um dos extratos de microalgas promoveu o crescimento dos peixes, elevou o conteúdo mineral vertebral, reduziu a incidência de anomalias esqueléticas e estimulou os mecanismos anabólicos ósseos. Além disso, após 6 meses, durante os quais os peixes foram alimentados com dietas comerciais, os peixes originalmente alimentados com um dos extratos ainda eram maiores, menos deformados e com uma forma mais alongada e esbelta em comparação com os peixes controle. No Capítulo 6, cujo manuscrito está em preparação, e pretendemos submetê-lo à revista Biomedicine & Pharmacotherapy, exploramos mais profundamente o mecanismo de ação molecular de um dos dois extratos de algas mais promissores, os extratos etanólicos de Skeletonema costatum, e fornecemos informação relevante para futura validação do seu potencial para desenvolvimento de fármacos para tratar patologias ósseas humanas. Primeiro, ao testar o extrato num modelo de regeneração óssea baseado na amputação e regeneração da barbatana caudal do peixe-zebra, revelamos que o extrato inibia a bifurcação dos raios e o recrutamento osteoclástico. A aplicação de uma abordagem transcritómica revelou que o extrato suprimiu fortemente os processos inflamatórios e inibiu o recrutamento de macrófagos e a diferenciação osteoclástica nos estádios iniciais da regeneração da barbatana caudal. Em seguida, validamos a capacidade do extrato reduzir a perda óssea num modelo de osteoporose in vivo em medaka, mostrando que os peixes expostos aos extratos apresentaram perda óssea menos severa. No final, para explorar se os resultados obtidos nos modelos de peixes poderiam ser consistentes num modelo mamífero in vitro, mostramos que os extratos de S. costatum inibiram a proliferação e a diferenciação osteoclástica induzida por RANKL em células RAW 264.7 derivadas de murganho (Mus musculus). Em conjunto, os resultados obtidos fornecem fortes evidências da presença de compostos anti-reabsortivos em S. costatum, possivelmente atuando por um mecanismo anti-inflamatório, destacando o potencial dessa espécie de microalga para o desenvolvimento de fármacos direcionados para tratamento de distúrbios ósseos humanos. No final, no Capítulo 7, fornecemos as principais conclusões sobre os resultados obtidos durante este projeto de doutoramento, enquadrando-os nos objetivos gerais do projeto BIOMEDAQU, salientando igualmente as possíveis contribuições que poderão trazer para as áreas de aquacultura e investigação biomédica. | pt_PT |
| dc.description.sponsorship | Work financed by the European Commission through Marie Skłodowska-Curie innovative training network BIOMEDAQU (grant H2020-MSCA-ITN/766347) and by the Portuguese Foundation for Science and Technology Ph.D. Fellowship 2021.05406.BD. This thesis also received support from the operational programmes European Maritime and Fisheries Fund (EMFF/FEAMP) through the National Operational Programme MAR2020 (grant 16-02-01-FMP-0057/OSTEOMAR), the European Regional Development Fund (ERDF/FEDER) through the Transnational Cooperation Programme Atlantic Area (grant EAPA/151/2016/BLUEHUMAN), and from national funds through the Portuguese Foundation for Science and Technology through projects UIDB/04326/2020, UIDP/04326/2020, LA/P/0101/2020, the European territorial cooperation program through the project ALGARED+ (grant INTERREG Portugal-Spain 0055 ALGARED+ 5E), and CRESC Algarve 2020 and COMPETE 2020 through project EMBRC.PT ALG-01-0145-FEDER-022121. | pt_PT |
| dc.identifier.tid | 101744099 | pt_PT |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/10400.1/20069 | |
| dc.language.iso | eng | pt_PT |
| dc.relation | Algarve Centre for Marine Sciences | |
| dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ | pt_PT |
| dc.subject | Microalgas | pt_PT |
| dc.subject | Skeletonema costatum | pt_PT |
| dc.subject | Tetraselmis striata ctp4 | pt_PT |
| dc.subject | Compostos bioativos marinhos | pt_PT |
| dc.subject | Osteoanabólico | pt_PT |
| dc.subject | Pró-osteogênico | pt_PT |
| dc.subject | Mineralogénico | pt_PT |
| dc.title | Effect of marine-derived extracts on mineralogenesis | pt_PT |
| dc.type | doctoral thesis | |
| dspace.entity.type | Publication | |
| oaire.awardTitle | Algarve Centre for Marine Sciences | |
| oaire.awardURI | info:eu-repo/grantAgreement/FCT/6817 - DCRRNI ID/UIDB%2F04326%2F2020/PT | |
| oaire.fundingStream | 6817 - DCRRNI ID | |
| person.familyName | Carletti | |
| person.givenName | Alessio | |
| person.identifier.ciencia-id | BE18-E938-C489 | |
| person.identifier.orcid | 0000-0003-2593-2499 | |
| project.funder.identifier | http://doi.org/10.13039/501100001871 | |
| project.funder.name | Fundação para a Ciência e a Tecnologia | |
| rcaap.rights | embargoedAccess | pt_PT |
| rcaap.type | doctoralThesis | pt_PT |
| relation.isAuthorOfPublication | de59dc85-3f95-492f-ac2f-d2748375fbe2 | |
| relation.isAuthorOfPublication.latestForDiscovery | de59dc85-3f95-492f-ac2f-d2748375fbe2 | |
| relation.isProjectOfPublication | fafa76a6-2cd2-4a6d-a3c9-772f34d3b91f | |
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| thesis.degree.grantor | Universidade do Algarve. Faculdade de Medicina e Ciências Biomédicas | |
| thesis.degree.level | Doutor | |
| thesis.degree.name | Doutoramento em Ciências Biomédicas | pt_PT |