Isolamento de inibidores de proteases a partir de culturas de células vegetais com actividade antimalárica

Paz, Tânia Solange Vieira

http://hdl.handle.net/10400.1/2898

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Dissertação - Tânia Paz - nº 21435.pdf		3.81 MB	Adobe PDF	Download

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Authors

Paz, Tânia Solange Vieira

Advisor(s)

Domingos, Ana

Raposo, Sara

Abstract(s)

A malária é uma das doenças tropicais infecciosas causada pelo parasita protozoário unicelular do género Plasmodium. É uma doença endémica em 105 países, responsável por 300 a 500 milhões de casos clínicos anualmente, causando a morte de mais de um milhão de pessoas. Devido ao aumento da resistência de alguns parasitas aos fármacos sintéticos têm vindo a ser desenvolvidos estudos no sentido de encontrar novos fármacos naturais, nomeadamente extractos de plantas. O presente trabalho teve como principal objectivo analisar a actividade inibitória, através da cultura in vitro, que os calli das diferentes espécies testadas apresentavam face a duas proteases, uma protease cisteínica e uma protease serínica, papaína e tripsina respectivamente, e identificar os componentes com acção inibitória. Neste tipo de estudo são utilizadas, normalmente, partes da planta como folhas, raízes, caules e sementes, contudo, a flora portuguesa não possui todas as espécies em estudo. Podemos encontrar apenas Ailanthus altissima, Mercurialis annua e Euphorbia peplus. Como forma de contornar esta dificuldade, procedeu-se ao estabelecimento in vitro de calli e de culturas de células em suspensão das diferentes espécies em estudo. Assim sendo, através da cultura in vitro, pretendeu-se analisar a actividade inibitória que os calli das diferentes espécies testadas apresentavam face a duas proteases, uma protease cisteínica e uma protease serínica, papaína e tripsina respectivamente, e identificar os componentes com acção inibitória. Para determinar a actividade inibitória dos extractos de calli, efectuaram-se ensaios fluorimétricos e ensaios de deteção de actividade em géis de poliacrilamida. Os resultados de fluorimetria sugerem que o extracto de calli de Ailanthus altissima possui actividade inibitória enquanto que o extracto de Catharanthus roseus não demonstra inibir as proteases do extracto. A actividade proteolítica da papaína é inibida na presença do extracto de folhas frescas de Euphorbia peplus após extracção com diferentes solventes orgânicos, mas não ocorre inibição do extracto proveniente de calli desta espécie. No entanto, para o extracto de folhas frescas de E. peplus, extraído Isolamento de inibidores de proteases a partir de culturas de células vegetais com actividade antimalárica 2009 viii em Tris-EDTA, não se verificou uma inibição da actividade em relação à papaína 500 μg/mL. A inibição da actividade enzimática da protease papaína em presença de extractos de Euphorbia peplus obtidos com diferentes solventes foi também avaliada em gel de poliacrilamida contendo gelatina. Verificou-se que os extractos extraídos com diferentes solventes na presença de protease papaína, apresentaram uma redução da sua actividade enzimática. Foi avaliada a actividade citotóxica do extracto de folhas frescas de E. peplus utilizando o teste de toxicidade no qual se obteve um valor DL50 (concentração letal de 50% da população) de 90,5 μg/mL. Este é um valor que indica alguma toxicidade por parte do extracto. A identificação dos inibidores foi efectuada uma através de uma análise GC-MS com a qual não foi possível identificar compostos constituintes de E.peplus. Uma vez que os métodos utilizados não revelaram resultados conclusivos, serão utilizados futuramente outros métodos e/ou dosagens.