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Identification of genes regulated by mir-363*, a regulator of bone marrow endothelial cell properties
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Authors
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Abstract(s)
As células estaminais hematopoiéticas residem na medula óssea e
possuem capacidade para se auto-renovar e dar origem a todos os tipos de
células sanguíneas. O endotélio da medula óssea é constituído por células
endoteliais de medula óssea (BMEC) e compreende dois nichos com funções
distintas: o nicho osteoblástico e o nicho vascular. O nicho osteoblásctico
proporciona condições para a quiescência de células estaminais
hematopoiéticas, enquanto no nicho vascular ocorre proliferação e
diferenciação das mesmas. Quando ocorre um desequilíbrio na expressão de
genes que codificam para proteínas envolvidas na mobilização de células do
nicho osteoblástico para o nicho vascular – factores angiócrinos – ocorre uma
desestabilização do microambiente medular, que se pode traduzir num
processo tumoral.
Os microRNAs (miRNAs) são uma classe de RNAs não codificantes, de
cadeia simples, que regula a expressão génica. Os miRNAs são sequências
endógenas de RNA que possuem entre 19 e 25 nucleótidos de tamanho. Os
miRNAs são reguladores da expressão genica, induzindo o silenciamento a
nível da pós-transcrição, através da sua ligação com uma sequência específica
para a qual possuem afinidade, na região 3’ não traduzida (3’ UTR) dos seus
mRNA alvo, conduzindo à inibição da tradução ou à sua degradação. Os
miRNAs estão envolvidos na regulação de genes de diversas vias afectando
processos fundamentais como hematopoiese, apoptose, proliferação celular e
tumorigénese. Os níveis de expressão dos miRNAs estão alterados no cancro,
podendo actuar directamente como supressores de tumor ou como oncogenes,
sendo neste caso denominados de oncomirs. Os perfis dos níveis de
expressão de vários miRNAs foram estudados, tendo-se verificado que se
alteram durante o processo de carcinogénese, podendo actuar directamente
como supressores de tumor ou como oncogenes, sendo neste caso
denominados de oncomirs. Apesar do miR-363* estar envolvido na regulação
da expressão de genes que regulam propriedades das células endoteliais e
medula óssea, os genes sobre os quais exerce a sua função ainda não foram
identificados.O objectivo do presente estudo é a identificação dos genes directamente
regulados pelo miR-363* (genes alvo) e a sua relevância para a disfunção
medular e a sua caracterização nos síndromes mielodisplásicos. A estratégia
usada baseou-se na redução ou aumento forçados dos níveis de miR-363* em
células endoteliais e subsequente análise da expressão génica através de
microarrays de cDNA do genoma humano. A redução do miR-363* vai implicar
o aumento da expressão dos seus genes alvo, assim como o aumento dos
níveis do miR-363* vai induzir a degradação e consequente redução dos seus
genes alvos. A intersecção dos dados gerados através do estudo da expressão
com bases de dados que possuem algoritmos para previsão de genes alvo
directos dos miRNAs (miRBase e MicroCosm Targets) permitiu restringir os
genes a analisar a sete genes, nomeadamente BST1, ESAM, FCER1G,
IKBKG, SELE, THBS3 e TIMP1. A interacção directa destes candidatos a alvos
directos do miR-363* foi posteriormente validada. Para tal, as 3’UTR dos genes
foram clonadas num vector que contém o gene da luciferase. Uma vez as
clonagens realizadas, efectuaram-se ensaios funcionais em células endoteliais,
nomeadamente HUVEC, nas quais se co-transfectaram os vectores gerados,
anti-miRs ou pre-miRs (para diminuir ou aumentar o nível de miRNA) e o
plasmídeo controlo da Renilla para normalização dos ensaios de luciferase. A
variação da luminescência obtida em presença do aumento ou redução do
miR-363* deu uma forte indicação da regulação directa do miR-363* nesses
alvos. No entanto, a confirmação desta interacção directa foi efectuada através
de ensaios de mutagénese, nos quais de induziram mutações na 3’UTR nos
locais de ligação do miRNA, seguidos dos ensaios funcionais como acima
descritos. Esta estratégia sugere que o TIMP1, inibidor da metaloprotease-9
(MMP-9), é regulado directamente pelo miR-363*.
Adicionalmente, os níveis de expressão dos alvos directos do miR-363*
foram estudados em 17 amostras de aspirados de medula óssea de doentes
com síndromes mielodisplásicos. Os síndromes mielodisplásicos são
caracterizados como um grupo heterogéneo de condições, que apresentam
citopenias (produção deficiente de eritrócitos, leucócitos e/ou megacariócitos) e
medula óssea displástica e hipercelular. A escalonagem dos doentes foi feita
de acordo com o sistema de prognóstico IPSS elaborado pela Organização Mundial de Saúde, e que consiste numa tabela de risco de progressão de
síndromes mielodisplásicos para leucemia mielóide aguda (LMA) e que agrupa
os doentes em baixo risco – que compreende os níveis baixo e intermédio 1 – e
em alto risco – que compreende os níveis intermédio 2 e alto. Dos genes
regulados pelo miR-363*, o destacam-se o TIMP1, estando aumentando em
doentes com mau prognóstico, e o THBS3 que apresenta um aumento nos
doentes com prognóstico intermédio. Em suma, os estudos realizados
permitiram a identificação de genes regulados pelo miR-363* e contribuiram
para o conhecimento de como o miR-363* contribui para a disfunção medular,
particularmente em síndromes mielodisplásicos, pela desregulação das
propriedades endoteliais.
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Keywords
Ciências biomédicas Leucemia Células Medula óssea Avaliação de riscos