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Publication
Estudo da execução e controlo da proliferação de células humanas
| Name: | Description: | Size: | Format: | |
|---|---|---|---|---|
| 2.89 MB | Adobe PDF |
Authors
Advisor(s)
Abstract(s)
Regulation of cell proliferation is of crucial importance to all multicellular organisms. The
faithful transmission of genetic material relies upon the connection between chromosomes
and the mitotic spindle. Errors can result in aneuploidy with consequent cell death or cancer
formation.
This work was dedicated to studying a human MOB4, an uncharacterised member of the
MOB-like proteins family. Preliminary results from our laboratory point for MOB4
localisation at the mitotic spindle, MOB4 was observed at centrosomes. In the absence of
MOB4, CENP-A is lost from kinetochores. MOB4 downregulation causes severe mitotic
defects, mitotic block, and cell death. However, the mechanism by which this protein acts is
undetermined.
To better understand MOB4 function, nocodazole assays were held to study if MOB4
localisation could be altered when microtubules are depolymerised. Results suggest that
MOB4 still localises at centrosomes. Afterwards, cells were treated with MG132 for
metaphase block and analysis of MOB4 localisation at kinetochores. MOB4 does not appear
to be localised at kinetochores in my working conditions. In addition, in cells treated with
MG132, I observed MOB4 accumulations in the nucleus periphery of interphase cells. These
results suggest that MOB4 accumulates in Golgi Complex during G2. In order to understand
if these aggregates result from the MOB4 levels increase, I compared MOB4 protein levels of
interphase cells and cells blocked in mitosis. Western blot results indicate that MOB4
concentration is stable during the cell cycle.
Furthermore, I wanted to know if these aggregates are dependent on microtubules. Cells were
incubated with MG132 and nocodazole. MOB4 aggregates were observed in cells with and
without microtubules. Additionally, some cells with depolymerised microtubules present
separate accumulations of MOB4.
With this work, I can conclude that, in mitosis, MOB4 localises at centrosomes with and
without the microtubules. MOB4 accumulates in Golgi Complex during G2, and these
aggregates are independent of microtubules. Levels of MOB4 protein are stable during the
cell cycle.
Regulação de proliferação celular é de importância crucial para todos os organismos multicelulares. A transmissão fiel do material genético para as células filhas depende da ligação correta entre os cromossomas e o fuso mitótico. Erros aqui podem resultar na morte celular ou podem levar à formação de cancro. A segregação cromossómica é conseguida pela interação entre os microtúbulos do fuso e os cinetocoros nos centrómeros. Os centrómeros em células humanas são definidos epigeneticamente por nucleossomas contendo CENP-A, que define o local de montagem do cinetocoro. A segregação cromossómica é conseguida através da regulação fina das interações cinetocoro-microtúbulo e a atividade correta de ativadores ou inibidores em estádios específicos da mitose. Apesar de sua importância, como os cinetocoros são montados, regulados e como funcionam durante a segregação cromossómica, estes são fenómenos ainda não totalmente compreendidos. MOB4 é um membro essencial, que pertence a uma família de proteínas do tipo MOB, requerido para a transição entre metáfase e anáfase. A sua depleção resulta em defeitos severos na congregação e alinhamento dos cromossomas, e bloqueio mitótico. Para além de que células depletadas de MOB4 apresentam perda de CENP-A dos cinetocoros mitóticos. Ao mesmo tempo, CENP-E, membro de cinetocoro externo não é afetado. Também foi identificada a localização de MOB4 no fuso mitótico, MOB4 foi observado nos centrossomas. No contexto fisiológico, MOB4 apresenta ser um gene essencial sendo a sua deleção em D. melanogaster mutantes letal na fase de larva. Estas apresentavam tumores melanocíticos, mais uma vez alertando à conexão entre MOB4 e carcinogénese. Bases de dados de proteínas mostram que a proteína MOB4 é altamente expressa em vários tipos de cancro, sugerindo o seu papel proto-oncogénico. O mecanismo pelo qual MOB4 contribui para a evolução e a progressão tumoral ainda é por ser definido. Um dos objetivos deste trabalho foi identificar se o MOB4 é essencial para a ligação entre cinetocoro e microtúbulo. Células foram submetidas a despolimerização de microtúbulos no gelo, com consequente recuperação de microtúbulos. Este processo permitiu determinar tempo necessário para completa despolimerização de microtúbulos e para aparecimento de primeiros microtúbulos nucleados. Para a melhor compreensão da função de MOB4, células foram tratadas com nocodazole, para identificar se a localização centrosomal de MOB4 em células mitóticas é alterada na ausência de microtúbulos. Nas condições de trabalho realizado, consegui demonstrar que MOB4 continua a ser localizado nos centrossomas na presença e na ausência de microtúbulos. Resultados prévios a este trabalho, sugerem que MOB4 tem um papel importante para a acumulação de CENP-A nos cinetocoros. Estes dados deram origem à hipótese de que o MOB4 pode estar localizado nos cinetocoros. Para testar esta hipótese, as células foram tratadas com MG132, para bloqueio em metáfase e análise da possível localização de MOB4 nos cinetocoros. Nas minhas condições de trabalho, os resultados sugerem que MOB4 não se localiza nos cinetocoros. Contudo, em células tratadas com MG132 foi possível observar um elevado número de células interfásicas com MOB4 localizado na região perinuclear. Este resultado indica que esta localização correspondente ao Complexo Golgi, e estes agregados de MOB4 são formados durante G2, o que está de acordo com os resultados prévios do nosso laboratório. Para compreender se os agregados de MOB4 são resultado do aumento dos seus níveis na célula, células foram tratadas com timidina e STLC, para o bloqueio em mitose. A análise proteica de células não tratadas e de células bloqueadas em mitose foi feita por meio de Western blot. Os resultados obtidos sugerem que os níveis de MOB4 são estáveis durante o ciclo celular. Este resultado é comum para pelo menos duas linhas celulares diferentes. Para prosseguir com a análise dos agregados de MOB4, células foram incubadas com MG132 na presença de nocodazole, para identificar se estes agregados são dependentes de microtúbulos. Foi possível observar agregados de MOB4 no Complexo Golgi na presença e na ausência de microtúbulos. Estes resultados indicam que a localização de MOB4 aparenta ser independente da presença de microtúbulos. Além disso, foram observadas células com mais que uma acumulação de MOB4 na zona perinuclear de células quando estas foram tratadas com MG132 e nocodazole. Este acontecimento não teve lugar em células tratadas com MG132. Células incubadas com nocodazole apresentam baixo número de células interfásicas com agregados de MOB4 no Complexo Golgi. Este número é comparável ao controlo. Para a localização e estudo de proteína de interesse, foram usadas células CRAL1, que expressam MOB4-GFP, geradas a partir de células HCT116. Esta linha celular permitiu amplamente identificar a localização e o comportamento da proteína MOB4. Como trata-se duma linha celular originadas por meio de isolamento clonal, é necessário criar várias linhas celulares criadas sob condições similares. Foi usada a tecnologia CRISPR/Cas9, para inserção da sequência de interesse pela recombinação homóloga para criar clones que expressam a proteína MOB4 acoplada com uma proteína de fluorescência que torne possível a visualização desta proteína na célula. Este trabalho permitiu mostrar que MOB4 permanece localizado nos centrossomas de células interfásicas na ausência de microtúbulos. A proteína MOB4 forma agregados no Complexo Golgi durante G2, sendo acumulação destes agregados independente dos microtúbulos. Os níveis proteicos de MOB4 são estáveis durante o ciclo celular.
Regulação de proliferação celular é de importância crucial para todos os organismos multicelulares. A transmissão fiel do material genético para as células filhas depende da ligação correta entre os cromossomas e o fuso mitótico. Erros aqui podem resultar na morte celular ou podem levar à formação de cancro. A segregação cromossómica é conseguida pela interação entre os microtúbulos do fuso e os cinetocoros nos centrómeros. Os centrómeros em células humanas são definidos epigeneticamente por nucleossomas contendo CENP-A, que define o local de montagem do cinetocoro. A segregação cromossómica é conseguida através da regulação fina das interações cinetocoro-microtúbulo e a atividade correta de ativadores ou inibidores em estádios específicos da mitose. Apesar de sua importância, como os cinetocoros são montados, regulados e como funcionam durante a segregação cromossómica, estes são fenómenos ainda não totalmente compreendidos. MOB4 é um membro essencial, que pertence a uma família de proteínas do tipo MOB, requerido para a transição entre metáfase e anáfase. A sua depleção resulta em defeitos severos na congregação e alinhamento dos cromossomas, e bloqueio mitótico. Para além de que células depletadas de MOB4 apresentam perda de CENP-A dos cinetocoros mitóticos. Ao mesmo tempo, CENP-E, membro de cinetocoro externo não é afetado. Também foi identificada a localização de MOB4 no fuso mitótico, MOB4 foi observado nos centrossomas. No contexto fisiológico, MOB4 apresenta ser um gene essencial sendo a sua deleção em D. melanogaster mutantes letal na fase de larva. Estas apresentavam tumores melanocíticos, mais uma vez alertando à conexão entre MOB4 e carcinogénese. Bases de dados de proteínas mostram que a proteína MOB4 é altamente expressa em vários tipos de cancro, sugerindo o seu papel proto-oncogénico. O mecanismo pelo qual MOB4 contribui para a evolução e a progressão tumoral ainda é por ser definido. Um dos objetivos deste trabalho foi identificar se o MOB4 é essencial para a ligação entre cinetocoro e microtúbulo. Células foram submetidas a despolimerização de microtúbulos no gelo, com consequente recuperação de microtúbulos. Este processo permitiu determinar tempo necessário para completa despolimerização de microtúbulos e para aparecimento de primeiros microtúbulos nucleados. Para a melhor compreensão da função de MOB4, células foram tratadas com nocodazole, para identificar se a localização centrosomal de MOB4 em células mitóticas é alterada na ausência de microtúbulos. Nas condições de trabalho realizado, consegui demonstrar que MOB4 continua a ser localizado nos centrossomas na presença e na ausência de microtúbulos. Resultados prévios a este trabalho, sugerem que MOB4 tem um papel importante para a acumulação de CENP-A nos cinetocoros. Estes dados deram origem à hipótese de que o MOB4 pode estar localizado nos cinetocoros. Para testar esta hipótese, as células foram tratadas com MG132, para bloqueio em metáfase e análise da possível localização de MOB4 nos cinetocoros. Nas minhas condições de trabalho, os resultados sugerem que MOB4 não se localiza nos cinetocoros. Contudo, em células tratadas com MG132 foi possível observar um elevado número de células interfásicas com MOB4 localizado na região perinuclear. Este resultado indica que esta localização correspondente ao Complexo Golgi, e estes agregados de MOB4 são formados durante G2, o que está de acordo com os resultados prévios do nosso laboratório. Para compreender se os agregados de MOB4 são resultado do aumento dos seus níveis na célula, células foram tratadas com timidina e STLC, para o bloqueio em mitose. A análise proteica de células não tratadas e de células bloqueadas em mitose foi feita por meio de Western blot. Os resultados obtidos sugerem que os níveis de MOB4 são estáveis durante o ciclo celular. Este resultado é comum para pelo menos duas linhas celulares diferentes. Para prosseguir com a análise dos agregados de MOB4, células foram incubadas com MG132 na presença de nocodazole, para identificar se estes agregados são dependentes de microtúbulos. Foi possível observar agregados de MOB4 no Complexo Golgi na presença e na ausência de microtúbulos. Estes resultados indicam que a localização de MOB4 aparenta ser independente da presença de microtúbulos. Além disso, foram observadas células com mais que uma acumulação de MOB4 na zona perinuclear de células quando estas foram tratadas com MG132 e nocodazole. Este acontecimento não teve lugar em células tratadas com MG132. Células incubadas com nocodazole apresentam baixo número de células interfásicas com agregados de MOB4 no Complexo Golgi. Este número é comparável ao controlo. Para a localização e estudo de proteína de interesse, foram usadas células CRAL1, que expressam MOB4-GFP, geradas a partir de células HCT116. Esta linha celular permitiu amplamente identificar a localização e o comportamento da proteína MOB4. Como trata-se duma linha celular originadas por meio de isolamento clonal, é necessário criar várias linhas celulares criadas sob condições similares. Foi usada a tecnologia CRISPR/Cas9, para inserção da sequência de interesse pela recombinação homóloga para criar clones que expressam a proteína MOB4 acoplada com uma proteína de fluorescência que torne possível a visualização desta proteína na célula. Este trabalho permitiu mostrar que MOB4 permanece localizado nos centrossomas de células interfásicas na ausência de microtúbulos. A proteína MOB4 forma agregados no Complexo Golgi durante G2, sendo acumulação destes agregados independente dos microtúbulos. Os níveis proteicos de MOB4 são estáveis durante o ciclo celular.
Description
Keywords
MOB4 Microtúbulos Fuso mitótico Golgi Interfase