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Publication
The influence of inflammatory processes in fish skeletal development: the crosstalk between skeletal and immune systems
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Authors
Abstract(s)
Osteoimmunology is an emerging field focused on the comprehension of the crosstalk between the immune and skeletal systems, with a particular focus on how inflammation affects bone health and disease. Previous research suggests that the same signalling mechanism that occurs in mammals may trigger the differentiation of macrophages into osteoclasts in teleosts, leading to the onset of pathological bone resorption by an identical molecular process. However, little is known about the contribution of the inflammatory processes and or bacterial constituents in fish bone tissues. In this thesis, we tackle this issue by evaluating the impact of continuous exposure to bacterial lipopolysaccharides (LPS) in zebrafish dermal skeleton (scales) and evaluating the potential of the microalga Tisochrysis lutea ethanolic extract and its glycolipid (GL) fractions to reverse the LPS effects. The continuous exposure to LPS led to the reduction of de novo formed scales and led to scale demineralization, with increased osteoclast activity, and inflammatory and osteoclastic marker genes (i.e., tnfa, ctsk, and acp5). In ex vivo cultured scales, LPS led to an increase in the number of osteoclast areas, while reducing the number of macrophages. An overlap between cell types and TRAP+ signals indicates the possible differentiation of macrophages into osteoclasts. T. lutea extract and two isolated glycolipid fractions (Tl-glF1 and Tl-glF2) evidenced an anti-osteoclastic potential against the differentiation of RAW 264.7-derived osteoclasts (RAW-Ocs), with a reduced number of mono- and multinucleated osteoclasts. The data collected in this thesis supports the use of zebrafish scales exposed to LPS at 10 μg mL-1 as an in vivo and ex vivo screening method for searching novel anti-resorptive compounds for inflammatory diseases, to study the mechanisms involved in increased bone resorption, and the role of LPS in the differentiation of macrophages into osteoclasts. T. lutea GLs contain anti-resorptive properties and should be further investigated for their application in osteoimmune diseases.
A osteoimunologia consiste numa área emergente de investigação biomédica focada na compreensão da interação existente entre o sistema imunológico e o sistema esquelético. Esta área tem como um dos principais objectivos compreender os efeitos associados ao processo inflamatório com o desenvolvimento de doenças ósseas, como é o caso da osteoporose, periodontite dentária e artrite reumatoide. Estudos em mamíferos demonstraram que a inflamação crónica estéril, desencadeada pelo próprio organismo, ou com uma origem bacteriana, através de lipopolissacarídeos (LPS) ou outros constituintes bacterianos, desencadeiam a liberação de citocinas pró-inflamatórias (e.g., TNF-α, IL1β, IL6) que são conhecidas por induzir a reabsorção óssea por intermédio de osteoclastos. A inflamação crónica vai contribuir deste modo para o desenvolvimento das doenças ósseas. Estudos anteriores sugerem que o mesmo mecanismo de sinalização descritos nos mamíferos possam ser igualmente desencadeados em teleósteos, em que ocorre a diferenciação de macrófagos em osteoclastos, tanto através da sinalização do RANKL, quanto pela exposição a LPS. Deste modo, o início da reabsorção óssea patológica pode ser causado por um processo molecular idêntico ou similar. No entanto, pouco se sabe sobre a contribuição dos processos inflamatórios e ou dos constituintes bacterianos em teleósteos. Nesta tese, abordamos esta questão avaliando o impacto no peixe-zebra (Danio rerio) da exposição contínua de LPS no esqueleto dérmico (escamas) em formação/desenvolvimento ósseo. Através da colheita de escamas e seu cultivo através de técnicas de cultura celular com estimulação contínua de LPS, avaliámos o potencial do extrato etanólico da microalga Tisochrysis lutea. Procedeu-se ao fracionamento do mesmo extrato de modo a obter duas frações ricas em glicolípidos, de forma a avaliar o seu potencial para reverter os efeitos causados pelos LPS. No Capítulo 2, foi utilizada a exposição contínua ao LPS de forma a induzir um processo inflamatório e investigar os seus efeitos no processo regenerativo e nas alterações na formação de novo tecido ósseo. A exposição contínua ao LPS levou à redução do tamanho das escamas formadas/regeneradas, seja por um atraso no seu processo de regeneração óssea, devido à inflamação excessiva perturbar a formação de novo tecido ósseo pela inibição da diferenciação de osteoblastos ou devido à atividade excessiva de osteoclastos observada. O LPS a 10 μg mL-1 levou aos resultados mais drásticos com a redução na área da escama, aumento da razão entre a atividade osteoclástica (através da atividade da enzima TRAP) e o tamanho da escama e incremento ao nível dos marcadores genéticos associados à reabsorção óssea (acp5a e oc-stamp). Consequentemente, o LPS induziu a desmineralização das escamas. No Capítulo 3, foram utilizadas linhas repórter de peixe-zebra, o Tg(mpeg1.1:GFPgl22;ctsk:DsRed) para a identificação/sinalização de macrófagos e osteoclastos e o Tg(sp7:mCherrypd43) para identificação/sinalização de (pré)osteoblastos de modo a avaliar o impacto do LPS nos macrófagos e a sua possível contribuição para a formação de osteoclastos, e impacto nos osteoblastos. Para tal, foi efetuada a colheita de escamas e a sua cultura através de técnicas de cultura celular. O LPS contribuiu para a desmineralização da escama, levou ao aumento na atividade da enzima TRAP e marcadores genéticos associados à reabsorção óssea (ctsk e acp5), mas também ao número de áreas associadas a presença de osteoclastos (áreas ctsk+), assim como à diminuição do número de macrófagos. Os dados demonstram uma sobreposição de sinal entre os dois tipos celulares (macrófagos e osteoclastos), bem como a sobreposição do sinal TRAP+, indicando a possível diferenciação de macrófagos em osteoclastos. No Capítulo 4, avaliamos o potencial anti-osteoclástico do extrato etanólico da microalga T. lutea em osteoclastos derivados de células de ratinho RAW 264.7 (denominadas RAW-Ocs) sob diferenciação por intermédio da exposição com RANKL/M-CSF ou LPS. Além disso, avaliámos o potencial do extrato etanólico da microalga T. lutea no modelo de cultura de escamas com exposição a LPS, para estimular a reabsorção óssea. Os dados colhidos demonstraram que o extrato etanólico da microalga T. lutea inibe a diferenciação de células RAW-Ocs, a desmineralização das escamas e a redução da atividade da TRAP, além de promover a mineralização em células osteoblásticas de ratinho, MC3T3-E1. Considerando os resultados obtidos, foram isoladas duas frações de glicolipídios (Tl-glF1 e Tl-glF2) do extrato etanólico de T. lutea previamente testado e avaliado oseu potencial anti-osteoclástico em células RAW 264.7 sob diferenciação emRAW-Ocs. Ambas as frações isoladas apresentam diferentes perfis de glicolípidos. Enquanto a fração Tl-glF1 é composta principalmente por glicolípidos do tipo monogalactosildiacilglicerol (MGDG) e digalactosildiacilglicerol (DGDG), a fração Tl-glF2 é rica em glicolípidos do tipo Sulfoquinovosil diacilglicerol (SQDG) e esfingolipídios (Hesoxilceramidas). Apesar de suas diferentes composições, ambas as frações apresentaram uma capacidade inibitória na diferenciação de células RAW-Ocs e, curiosamente, também a redução no número de osteoclastos mono- e multinucleados. Notavelmente, nenhuma expressão do de fusão de osteoclastos Oc-stamp foi observada para Tl-glF1 a 20 e 40 μg mL-1 e Tl-glF2 a 20 μg mL-1, enquanto este marcador foi altamente expresso na fração para Tl-glF2 a 40 μg mL-1 Em conclusão, os dados colhidos apoiam i) o uso de escamas de peixe-zebra expostas a LPS a 10 μg mL-1 como um método de avaliação de moléculas com propriedades inibitórias de reabsorção para doenças associadas a processos inflamatórios, tal como para estudar os mecanismos envolvidos no aumento da reabsorção óssea associada a processos inflamatórios. Estes estudos são realizados tanto por exposição de peixes cujas escamas foram colhidas e formadas/regeneradas sob a co-exposição das moléculas de interesse e LPS, como através de cultura de escamas ex vivo, através de técnicas de cultura celular expostas a LPS; ii) a exposição contínua ao LPS desencadeia a diferenciação de macrófagos em osteoclastos, e iii) os glicolípidos derivados da microalga T. lutea contêm propriedades inibitórias de reabsorção óssea e inibem os osteoclastos multinucleados, e portanto deverão ser posteriormente estudados para sua aplicação em doenças osteoimunes.
A osteoimunologia consiste numa área emergente de investigação biomédica focada na compreensão da interação existente entre o sistema imunológico e o sistema esquelético. Esta área tem como um dos principais objectivos compreender os efeitos associados ao processo inflamatório com o desenvolvimento de doenças ósseas, como é o caso da osteoporose, periodontite dentária e artrite reumatoide. Estudos em mamíferos demonstraram que a inflamação crónica estéril, desencadeada pelo próprio organismo, ou com uma origem bacteriana, através de lipopolissacarídeos (LPS) ou outros constituintes bacterianos, desencadeiam a liberação de citocinas pró-inflamatórias (e.g., TNF-α, IL1β, IL6) que são conhecidas por induzir a reabsorção óssea por intermédio de osteoclastos. A inflamação crónica vai contribuir deste modo para o desenvolvimento das doenças ósseas. Estudos anteriores sugerem que o mesmo mecanismo de sinalização descritos nos mamíferos possam ser igualmente desencadeados em teleósteos, em que ocorre a diferenciação de macrófagos em osteoclastos, tanto através da sinalização do RANKL, quanto pela exposição a LPS. Deste modo, o início da reabsorção óssea patológica pode ser causado por um processo molecular idêntico ou similar. No entanto, pouco se sabe sobre a contribuição dos processos inflamatórios e ou dos constituintes bacterianos em teleósteos. Nesta tese, abordamos esta questão avaliando o impacto no peixe-zebra (Danio rerio) da exposição contínua de LPS no esqueleto dérmico (escamas) em formação/desenvolvimento ósseo. Através da colheita de escamas e seu cultivo através de técnicas de cultura celular com estimulação contínua de LPS, avaliámos o potencial do extrato etanólico da microalga Tisochrysis lutea. Procedeu-se ao fracionamento do mesmo extrato de modo a obter duas frações ricas em glicolípidos, de forma a avaliar o seu potencial para reverter os efeitos causados pelos LPS. No Capítulo 2, foi utilizada a exposição contínua ao LPS de forma a induzir um processo inflamatório e investigar os seus efeitos no processo regenerativo e nas alterações na formação de novo tecido ósseo. A exposição contínua ao LPS levou à redução do tamanho das escamas formadas/regeneradas, seja por um atraso no seu processo de regeneração óssea, devido à inflamação excessiva perturbar a formação de novo tecido ósseo pela inibição da diferenciação de osteoblastos ou devido à atividade excessiva de osteoclastos observada. O LPS a 10 μg mL-1 levou aos resultados mais drásticos com a redução na área da escama, aumento da razão entre a atividade osteoclástica (através da atividade da enzima TRAP) e o tamanho da escama e incremento ao nível dos marcadores genéticos associados à reabsorção óssea (acp5a e oc-stamp). Consequentemente, o LPS induziu a desmineralização das escamas. No Capítulo 3, foram utilizadas linhas repórter de peixe-zebra, o Tg(mpeg1.1:GFPgl22;ctsk:DsRed) para a identificação/sinalização de macrófagos e osteoclastos e o Tg(sp7:mCherrypd43) para identificação/sinalização de (pré)osteoblastos de modo a avaliar o impacto do LPS nos macrófagos e a sua possível contribuição para a formação de osteoclastos, e impacto nos osteoblastos. Para tal, foi efetuada a colheita de escamas e a sua cultura através de técnicas de cultura celular. O LPS contribuiu para a desmineralização da escama, levou ao aumento na atividade da enzima TRAP e marcadores genéticos associados à reabsorção óssea (ctsk e acp5), mas também ao número de áreas associadas a presença de osteoclastos (áreas ctsk+), assim como à diminuição do número de macrófagos. Os dados demonstram uma sobreposição de sinal entre os dois tipos celulares (macrófagos e osteoclastos), bem como a sobreposição do sinal TRAP+, indicando a possível diferenciação de macrófagos em osteoclastos. No Capítulo 4, avaliamos o potencial anti-osteoclástico do extrato etanólico da microalga T. lutea em osteoclastos derivados de células de ratinho RAW 264.7 (denominadas RAW-Ocs) sob diferenciação por intermédio da exposição com RANKL/M-CSF ou LPS. Além disso, avaliámos o potencial do extrato etanólico da microalga T. lutea no modelo de cultura de escamas com exposição a LPS, para estimular a reabsorção óssea. Os dados colhidos demonstraram que o extrato etanólico da microalga T. lutea inibe a diferenciação de células RAW-Ocs, a desmineralização das escamas e a redução da atividade da TRAP, além de promover a mineralização em células osteoblásticas de ratinho, MC3T3-E1. Considerando os resultados obtidos, foram isoladas duas frações de glicolipídios (Tl-glF1 e Tl-glF2) do extrato etanólico de T. lutea previamente testado e avaliado oseu potencial anti-osteoclástico em células RAW 264.7 sob diferenciação emRAW-Ocs. Ambas as frações isoladas apresentam diferentes perfis de glicolípidos. Enquanto a fração Tl-glF1 é composta principalmente por glicolípidos do tipo monogalactosildiacilglicerol (MGDG) e digalactosildiacilglicerol (DGDG), a fração Tl-glF2 é rica em glicolípidos do tipo Sulfoquinovosil diacilglicerol (SQDG) e esfingolipídios (Hesoxilceramidas). Apesar de suas diferentes composições, ambas as frações apresentaram uma capacidade inibitória na diferenciação de células RAW-Ocs e, curiosamente, também a redução no número de osteoclastos mono- e multinucleados. Notavelmente, nenhuma expressão do de fusão de osteoclastos Oc-stamp foi observada para Tl-glF1 a 20 e 40 μg mL-1 e Tl-glF2 a 20 μg mL-1, enquanto este marcador foi altamente expresso na fração para Tl-glF2 a 40 μg mL-1 Em conclusão, os dados colhidos apoiam i) o uso de escamas de peixe-zebra expostas a LPS a 10 μg mL-1 como um método de avaliação de moléculas com propriedades inibitórias de reabsorção para doenças associadas a processos inflamatórios, tal como para estudar os mecanismos envolvidos no aumento da reabsorção óssea associada a processos inflamatórios. Estes estudos são realizados tanto por exposição de peixes cujas escamas foram colhidas e formadas/regeneradas sob a co-exposição das moléculas de interesse e LPS, como através de cultura de escamas ex vivo, através de técnicas de cultura celular expostas a LPS; ii) a exposição contínua ao LPS desencadeia a diferenciação de macrófagos em osteoclastos, e iii) os glicolípidos derivados da microalga T. lutea contêm propriedades inibitórias de reabsorção óssea e inibem os osteoclastos multinucleados, e portanto deverão ser posteriormente estudados para sua aplicação em doenças osteoimunes.
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Keywords
Peixe-zebra Escamas Inflamação Reabsorção óssea Osteoclastos Microalgas Glicolípidos