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Abstract(s)
O diagnóstico é um dos principais meios de protecção de plantas em virologia
vegetal. Muito frequentemente seria vantajoso poder ainda complementar o diagnóstico
com informação sobre as estirpes que estão presentes num dado contexto epidemiológico.
Na maior parte dos casos isto não é possível devido à inexistência de métodos
apropriados de tipificação viral. Esta limitação tem também dificultado estudos de âmbito
mais teórico que envolvem a identificação de estirpes presentes em populações naturais e
que permitiriam melhor delinear as estratégias protecção. Num pequeno número de casos
tem sido possível obter esta informação pela análise dos perfis electroforéticos obtidos
pelo fracionamento de RNA bicatenário de origem viral ou, mais recentemente, a partir
da análise dos genomas virais amplificados por PCR.
Neste trabalho estudam-se métodos capazes de serem aplicados em condições de
rotina ao diagnóstico viral e à identificação de isolamentos de vírus, desenvolvendo-se
em três partes.
No primeiro capítulo estuda-se a aplicabilidade da análise de RNA bicatenário ao
diagnóstico viral, empregando para tal diversos vírus e hospedeiros. Verifica-se que este
método é muito dependente do hospedeiro e desenvolvem-se protocolos de extracção de
ácidos nucleicos que podem ser empregues com hospedeiros considerados difíceis, tais
como a videira. Não são contudo protocolos que possam ser empregues em condições de
rotina. Outras limitações provêm ainda da existência de RNA bicatenários endógenos que
foram encontrados em vários hospedeiros. Para além destes problemas, a possibilidade de
identificar estirpes depende ainda da estratégia de expressão genómica do vírus e do
hospedeiro estar a vegetar em condições apropriadas para a manifestação do perfil
completo de bandas. Em comparação com outros métodos que vieram a ser
desenvolvidos neste trabalho, a análise de RNA bicatenário apresenta um interesse
limitado quer no diagnóstico quer na tipificação viral. Poderá ter interesse como método
exploratório no estudo de doenças de etiologia presumivelmente viral ainda não
esclarecida, como por exemplo o mosaico da figueira, tratado neste trabalho. Esta doença
aparece relacionada com um perfil electroforético composto de várias bandas de que
sobressaem duas correspondentes a fragmentos de RNA bicatenário com cerca de 10-12
Kbp e 2,2 Kbp. Estas moléculas poderão estar relacionadas com a replicação de vírus de
RNA possívelmente envolvido(s) na patogénese.
Na segunda parte estudam-se os métodos de diagnóstico baseados na amplificação
in vitro de determinadas partes do genoma viral. Deste estudo resultou um método de
diagnóstico (IC/RT-PCR) de elevada sensitividade que evita a extracção de ácidos
nucleicos, o que não acontecia na metodologia até então disponível. Os viriões são
capturados directamente do extracto da planta mediante anticorpos adsorvidos sobre a
superfície de uma fase sólida, provavelmente sofrendo uma distorção que possibilita a
iii
extracção e transcrição do genoma pela RTase, seguindo-se a sua amplificação por PCR e
quantificação dos resultados por fluorimetria. Todo o processo pode ser efectuado numa
placa de microtitulação, sendo concebível um grau de automatização equivalente ao da
técnica ELISA. Este método foi objecto de um pedido de patente (Nolasco et al., 1992).
A sua validade foi verificada com vírus de diversos grupos (Potyvirus, Nepovirus,
Cucumovirus, Closterovirus, Luteovirus, Tobamovirus, Tospovirus) e com RNA satélites
de CMV e GFLV. Num pequeno rastreio de CTV e GFLV, comprovou-se a incapacidade
da técnica ELISA em detectar o vírus em várias amostras positivas por IC/RT-PCR. Por
outro lado, no caso do GFLV não foi possível amplificar alguns isolamentos positivos
por ELISA. Este facto foi atribuído a uma inesperada variabilidade genómica e reforça a
necessidade de se efectuarem estudos de variabilidade genómica de vírus.
Alternativamente à captura por anticorpos específicos, é possível capturar os genomas
virais por meio de anticorpos para RNA bicatenário, o que permite alargar o âmbito desta
metodologia a patogéneos desprovidos de proteína estrutural.
Na terceira parte estudou-se a conjugação da amplificação genómica por IC/RTPCR
com métodos de análise mutacional com vista ao desenvolvimento de métodos de
tipificação genómica de vírus. Dois destes métodos, a análise de polimorfismos
conformacionais monocatenários (SSCP) e de polimorfismos de locais de restrição (RSP)
empregam como técnica preparativa a amplificação específica por IC/RT-PCR e foram
objecto de um pedido de patente (Nolasco et al., 1993a). Um terceiro método, a Síntese
Aleatória de cDNA (SAcDNA), baseia a tipificação no aproveitamento das condições
pouco restritivas da transcrição reversa para iniciar, por jusante, mediante um iniciador
inespecífico, um conjunto de moléculas característico do isolamento viral, que é em
seguida amplificado em condições normais de restritividade. Este método foi também
objecto de um pedido de patente (Nolasco et al., 1994b). São características gerais dos
métodos apresentados poderem ser aplicados directamente ao extracto da planta a
analisar, serem independentes do hospedeiro e, comparativamente com outros métodos,
serem muito pouco laboriosos. Como modelo de aplicação empregou-se uma série de
isolamentos de GFLV e CTV, grande parte mantidos em condições naturais. Obteve-se o
melhor poder discriminante com SAcDNA. Para além da discriminação, a análise por
RSP permitiu ainda o estudo de relações entre isolamentos e a avaliação quantitativa da
diversidade genética de populações de GFLV e CTV, o que não havia sido feito
prèviamente. Verificou-se que o gene da proteína do capsídeo do GFLV é altamente
variável e que o distanciamento genético entre isolamentos não se relaciona com o
distanciamento espacial entre as plantas, mesmo quando lado a lado. A diversificação do
CTV segue um modelo distinto, relacionando-se a proximidade geográfica com a
proximidade genética entre os isolamentos e não se atingindo diversidades tão elevadas
como para o GFLV.
Description
Tese de dout., Ciências Agrárias (Protecção de Plantas), Unidade de Ciências e Tecnologias Agrárias, Univ. do Algarve, 1994
Keywords
Virologia vegetal Diagnóstico Protecção de plantas