| Nome: | Descrição: | Tamanho: | Formato: | |
|---|---|---|---|---|
| 40.28 MB | Adobe PDF |
Autores
Orientador(es)
Resumo(s)
Spinocerebellar ataxia type 2 (SCA2) is a polyglutamine disease caused by an abnormally long cytosine-adenine-guanine (CAG) expansion mutaron within the coding region of the ATXN2 gene. This mutaron produces an ataxin-2 protein form, which bears an overexpanded glutamine tract with neurotoxic properres. Despite the efforts, the pathogenic mechanisms underlying neurodegeneraron in SCA2 are srll poorly understood, and no therapy is available to delay or stop disease progression. In this work, we invesrgated the impact of stress granules (SGs) in SCA2 pathogenesis. SGs are dynamic membraneless organelles formed during the integrated stress response (ISR) to aid cells in coping with stress. Among other biological funcrons, these structures are thought to serve as local stores of untranslated mRNAs, allowing cells to priorirze the translaron of stress-resolving factors while reducing the energerc burden of global translaron during crircal periods. Emerging evidence suggests that persistent SGs under chronic stress condirons may have deleterious effects, potenrally contriburng to cellular dysfuncron and disease pathogenesis. Moreover, recent studies suggest that the ISR is overacrvated in several neurodegenerarve diseases, including Alzheimer's disease, amyotrophic lateral sclerosis, frontotemporal demenra, and Parkinson’s disease, potenrally promorng an exacerbated stress response and an aberrant formaron of SGs. Nevertheless, the role of SGs in the context of chronic stress and neurodegenerarve disorders, parrcularly in SCA2, is srll poorly addressed. Using both in vitro and in vivo models of SCA2, we observed that SGs assembly and disassembly differently modifies the pathological deficits associated with SCA2. Promorng the formaron of SGs within a limited rmeframe seems to have protecrve effects, while sustained inducron results in an exacerbated SCA2-associated phenotype, supporrng the hypothesis that chronic SGs persistence has deleterious effects. On the other hand, SGs sustained inhibiron seemed to have discrete deleterious effects. These findings suggest that SGs are cellular structures requiring a concerted and rghtly regulated control, and chronic
A ataxia espinocerebelosa do rpo 2 (SCA2, do inglês spinoceberellar ataxia type 2) é uma doença neurodegenerarva rara causada por uma expansão anormal do trinucleórdo adenina-citosina-guanina (CAG) na região codificante do gene ATXN2. A expansão anormal do trinucleórdo CAG está presente no primeiro exão do gene da ATXN2, e é responsável pela produção de uma proteína mutante, a ataxina-2, com um segmento de glutaminas anormalmente longo. A ataxina-2 mutante adquire funções tóxicas que comprometem o funcionamento normal das células, especialmente neurónios, resultando na sua morte. Indivíduos não afetados pela SCA2 também são portadores do gene ATXN2, o qual contém reperções CAG não patogénicas. Quando a expansão de CAG ultrapassa o limiar de 35 reperções, a SCA2 manifesta-se. A SCA2 está inserida num grupo de mais oito doenças, igualmente caracterizadas por uma expansão anormal do trinucleórdo CAG, nos respervos genes causadores da doença, denominadas doenças de poliglutaminas. Neste grupo estão incluídas: a doenças de Hunrngton, outras cinco ataxias espinocerebelosas (SCA1, SCA3, SCA6, SCA7 e SCA17), a atrofia dentato-rubro-palido-luisiana e atrofia muscular espinal e bulbar. A SCA2 afeta maioritariamente o sistema nervoso central, mas é no cerebelo, e em parrcular nas células de Purkinje, onde se observa uma marcada neurodegeneração selerva. Os indivíduos afetados manifestam um conjunto de sintomas que incluem a ataxia da marcha, movimento oculares lentos, dificuldades na fala (disartria), dificuldades na deglurção (disfagia), rigidez muscular e, em alguns casos, até parkinsonismo. Os mecanismos que conduzem à neurodegeneração, e consequentemente aos sintomas apresentados na SCA2, não estão ainda totalmente compreendidos; da mesma forma, a razão pela qual a expansão anormal de glutaminas é capaz de induzir toxicidade conrnua por esclarecer. Contudo, estão idenrficados diversos mecanismos celulares que contribuem para a SCA2 incluindo: agregação da proteína mutante ataxina-2, compromermento da autofagia, toxicidade associada ao RNA expandido, disfunção mitocondrial, stress oxidarvo exacerbado e desregulação na sinalização de cálcio. De modo a minimizar os efeitos tóxicos dos mecanismos celulares desregulados, as células desenvolveram vias específicas capazes de mirgar os efeitos deletérios dessas disfunções, como é o caso da resposta integrada ao stress (ISR, do inglês integrated stress response). A ISR é um mecanismo capaz de detetar várias formas de stress celular (infeções virais, escassez de aminoácidos, stress oxidarvo ou a presença de proteínas com conformações anormais), arvando respostas que visam restaurar a homeostasia celular. A ISR é iniciada quando, na presença de um es|mulo de stress, uma de quatro cinases – PERK, PKR, GCN2, e HRI – fosforila o eIF2α. Como consequência, a síntese global de proteínas é atenuada e formam-se os grânulos de stress (SGs, do inglês stress granules). Os SGs são estruturas dinâmicas que se formam imediatamente após a deteção de um stress celular. A sua composição compreende mRNAs não traduzidos, moléculas envolvidas na tradução e proteínas ligantes a RNA, que coalescem na formação destes organelos. Pensa-se que os SGs tenham como principal função o sequestro de mRNAs não essenciais para combater o stress celular, de modo a que as células consigam concentrar os seus recursos energércos na síntese de proteínas capazes de reestabelecer a homeostasia celular. Assim que o stress celular desaparece, os SGs são rapidamente dissociados. Esta dissociação dá-se após a desfosforilação do eIF2α pelo complexo de proteínas PP1:GADD34. Apesar do papel benéfico do SGs em situações de stress celular, nos úlrmos anos novas evidências mostram que, em situações de stress celular crónico, os SGs deixam de ser dinâmicos, apresentando uma elevada persistência. Uma das hipóteses predominantes na área é que em condições de stress permanente, a persistência na formação e manutenção de SGs tem efeitos nocivos para as células, podendo promover a morte celular. Diversos estudos sugerem que, em algumas doenças neurodegenerarvas, a ISR estás arva em níveis muito superiores aos normais, contribuído para patologia associada. Contudo o impacto dos SGs nestas condições não está totalmente estabelecido. Assim sendo, neste trabalho colocamos a hipótese de no contexto de SCA2 se verificar uma ISR exacerbada e uma desregulação na formação de SGs, devido a uma persistente manutenção do stress celular, caracterísrco das doenças neurodegenerarvas. Deste modo, o principal objervo deste trabalho é tentar compreender o impacto da formação e dissociação dos SGs no contexto de SCA2. Na primeira parte deste trabalho, desenvolvemos com sucesso ferramentas moleculares capazes de modular a dinâmicas dos SGs. Mais concretamente, desenvolvemos uma estratégia genérca capaz induzir a formação de SGs e uma estratégia genérca capaz de inibir a sua formação. Para induzir a formação de SGs desenvolvemos um fosfomimérco do eIF2α (eIF2αS52D), enquanto que para inibir a formação de SGs desenvolvemos uma forma truncada do GADD34Δ322. Ambas as estratégias foram validades in vitro. Usando as estratégias para modular a dinâmica dos SGs observamos que, in vitro, através do uso de neurónios primários de estriado, a expressão de eIF2αS52D (que induz a formação de SGs) é capaz de reestabelecer o comprimento total das dendrites, que é reduzido pela expressão da proteína ataxina-2 mutante. Contudo a expressão de GADD34Δ322 não impacta o comprimento das dendrites. Posteriormente, através de estudos in vivo, usando um modelo estriatal de SCA2, verificamos que a expressão de eIF2αS52D exacerba as caracterísrcas neuropatológicas associadas à expressão da ataxina-2 mutante no estriado. Os resultados parecem indicar que a expressão de GADD34Δ322 não impacta os achados neuropatológicos. Na úlrma parte deste trabalho, estudamos o impacto da expressão de eIF2αS52D (indução de SGs) e da expressão de GADD34Δ322 (inibição dos SGs) num novo modelo transgénico de SCA2, desenvolvido anteriormente no nosso grupo e caracterizado mais detalhadamente neste trabalho. Urlizando este novo modelo transgénico de SCA2, verificamos que expressão de eIF2αS52D exacerba o fenórpo associado a SCA2, tanto a nível motor, como a nível neuropatológico. A expressão de GADD34Δ322 parece ter também um impacto deletério na SCA2, embora mais discreto. Os resultados aparentemente discrepantes entres as experiências in vivo e vitro dão consistência à hipótese de que a formação de SGs limitada no tempo têm um impacto benéfico, enquanto a permanente manutenção e persistência dos SGs no tempo tem um impacto deletério. Mais ainda, o facto de termos observado que a expressão de GADD34Δ322 também tem um impacto negarvo, ainda que discreto, na patologia da SCA2 reforça a ideia de que os SGs são estruturas que exigem uma regulação altamente coordenada. Os resultados sugerem que alterar de forma crónica a formação ou dissociação dos SGs afeta negarvamente a patologia associada à SCA2, tendo a capacidade de alterar o curso normal da doença.
A ataxia espinocerebelosa do rpo 2 (SCA2, do inglês spinoceberellar ataxia type 2) é uma doença neurodegenerarva rara causada por uma expansão anormal do trinucleórdo adenina-citosina-guanina (CAG) na região codificante do gene ATXN2. A expansão anormal do trinucleórdo CAG está presente no primeiro exão do gene da ATXN2, e é responsável pela produção de uma proteína mutante, a ataxina-2, com um segmento de glutaminas anormalmente longo. A ataxina-2 mutante adquire funções tóxicas que comprometem o funcionamento normal das células, especialmente neurónios, resultando na sua morte. Indivíduos não afetados pela SCA2 também são portadores do gene ATXN2, o qual contém reperções CAG não patogénicas. Quando a expansão de CAG ultrapassa o limiar de 35 reperções, a SCA2 manifesta-se. A SCA2 está inserida num grupo de mais oito doenças, igualmente caracterizadas por uma expansão anormal do trinucleórdo CAG, nos respervos genes causadores da doença, denominadas doenças de poliglutaminas. Neste grupo estão incluídas: a doenças de Hunrngton, outras cinco ataxias espinocerebelosas (SCA1, SCA3, SCA6, SCA7 e SCA17), a atrofia dentato-rubro-palido-luisiana e atrofia muscular espinal e bulbar. A SCA2 afeta maioritariamente o sistema nervoso central, mas é no cerebelo, e em parrcular nas células de Purkinje, onde se observa uma marcada neurodegeneração selerva. Os indivíduos afetados manifestam um conjunto de sintomas que incluem a ataxia da marcha, movimento oculares lentos, dificuldades na fala (disartria), dificuldades na deglurção (disfagia), rigidez muscular e, em alguns casos, até parkinsonismo. Os mecanismos que conduzem à neurodegeneração, e consequentemente aos sintomas apresentados na SCA2, não estão ainda totalmente compreendidos; da mesma forma, a razão pela qual a expansão anormal de glutaminas é capaz de induzir toxicidade conrnua por esclarecer. Contudo, estão idenrficados diversos mecanismos celulares que contribuem para a SCA2 incluindo: agregação da proteína mutante ataxina-2, compromermento da autofagia, toxicidade associada ao RNA expandido, disfunção mitocondrial, stress oxidarvo exacerbado e desregulação na sinalização de cálcio. De modo a minimizar os efeitos tóxicos dos mecanismos celulares desregulados, as células desenvolveram vias específicas capazes de mirgar os efeitos deletérios dessas disfunções, como é o caso da resposta integrada ao stress (ISR, do inglês integrated stress response). A ISR é um mecanismo capaz de detetar várias formas de stress celular (infeções virais, escassez de aminoácidos, stress oxidarvo ou a presença de proteínas com conformações anormais), arvando respostas que visam restaurar a homeostasia celular. A ISR é iniciada quando, na presença de um es|mulo de stress, uma de quatro cinases – PERK, PKR, GCN2, e HRI – fosforila o eIF2α. Como consequência, a síntese global de proteínas é atenuada e formam-se os grânulos de stress (SGs, do inglês stress granules). Os SGs são estruturas dinâmicas que se formam imediatamente após a deteção de um stress celular. A sua composição compreende mRNAs não traduzidos, moléculas envolvidas na tradução e proteínas ligantes a RNA, que coalescem na formação destes organelos. Pensa-se que os SGs tenham como principal função o sequestro de mRNAs não essenciais para combater o stress celular, de modo a que as células consigam concentrar os seus recursos energércos na síntese de proteínas capazes de reestabelecer a homeostasia celular. Assim que o stress celular desaparece, os SGs são rapidamente dissociados. Esta dissociação dá-se após a desfosforilação do eIF2α pelo complexo de proteínas PP1:GADD34. Apesar do papel benéfico do SGs em situações de stress celular, nos úlrmos anos novas evidências mostram que, em situações de stress celular crónico, os SGs deixam de ser dinâmicos, apresentando uma elevada persistência. Uma das hipóteses predominantes na área é que em condições de stress permanente, a persistência na formação e manutenção de SGs tem efeitos nocivos para as células, podendo promover a morte celular. Diversos estudos sugerem que, em algumas doenças neurodegenerarvas, a ISR estás arva em níveis muito superiores aos normais, contribuído para patologia associada. Contudo o impacto dos SGs nestas condições não está totalmente estabelecido. Assim sendo, neste trabalho colocamos a hipótese de no contexto de SCA2 se verificar uma ISR exacerbada e uma desregulação na formação de SGs, devido a uma persistente manutenção do stress celular, caracterísrco das doenças neurodegenerarvas. Deste modo, o principal objervo deste trabalho é tentar compreender o impacto da formação e dissociação dos SGs no contexto de SCA2. Na primeira parte deste trabalho, desenvolvemos com sucesso ferramentas moleculares capazes de modular a dinâmicas dos SGs. Mais concretamente, desenvolvemos uma estratégia genérca capaz induzir a formação de SGs e uma estratégia genérca capaz de inibir a sua formação. Para induzir a formação de SGs desenvolvemos um fosfomimérco do eIF2α (eIF2αS52D), enquanto que para inibir a formação de SGs desenvolvemos uma forma truncada do GADD34Δ322. Ambas as estratégias foram validades in vitro. Usando as estratégias para modular a dinâmica dos SGs observamos que, in vitro, através do uso de neurónios primários de estriado, a expressão de eIF2αS52D (que induz a formação de SGs) é capaz de reestabelecer o comprimento total das dendrites, que é reduzido pela expressão da proteína ataxina-2 mutante. Contudo a expressão de GADD34Δ322 não impacta o comprimento das dendrites. Posteriormente, através de estudos in vivo, usando um modelo estriatal de SCA2, verificamos que a expressão de eIF2αS52D exacerba as caracterísrcas neuropatológicas associadas à expressão da ataxina-2 mutante no estriado. Os resultados parecem indicar que a expressão de GADD34Δ322 não impacta os achados neuropatológicos. Na úlrma parte deste trabalho, estudamos o impacto da expressão de eIF2αS52D (indução de SGs) e da expressão de GADD34Δ322 (inibição dos SGs) num novo modelo transgénico de SCA2, desenvolvido anteriormente no nosso grupo e caracterizado mais detalhadamente neste trabalho. Urlizando este novo modelo transgénico de SCA2, verificamos que expressão de eIF2αS52D exacerba o fenórpo associado a SCA2, tanto a nível motor, como a nível neuropatológico. A expressão de GADD34Δ322 parece ter também um impacto deletério na SCA2, embora mais discreto. Os resultados aparentemente discrepantes entres as experiências in vivo e vitro dão consistência à hipótese de que a formação de SGs limitada no tempo têm um impacto benéfico, enquanto a permanente manutenção e persistência dos SGs no tempo tem um impacto deletério. Mais ainda, o facto de termos observado que a expressão de GADD34Δ322 também tem um impacto negarvo, ainda que discreto, na patologia da SCA2 reforça a ideia de que os SGs são estruturas que exigem uma regulação altamente coordenada. Os resultados sugerem que alterar de forma crónica a formação ou dissociação dos SGs afeta negarvamente a patologia associada à SCA2, tendo a capacidade de alterar o curso normal da doença.
Descrição
Palavras-chave
Ataxia espinocerebelosa rpo 2 Ataxina-2 Neurodegeneração Stress celular Granules de stress