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Role of Ccbe1 during cardiac differentiation of mouse ESCs
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Authors
Advisor(s)
Abstract(s)
Das suas quatro cavidades à sua síncrona rede elétrica, o coração foi
perfeitamente projetado para servir de interface entre cada órgão presente no
corpo humano. Devido à sua complexidade, as doenças cardiovasculares
englobam também um grande conjunto de manifestações clínicas incluindo
miocardites, hipertensão arterial, defeitos congénitos cardíacos e doenças
isquémicas. Muitas destas patologias traduzem-se geralmente na perda de
tecido cardíaco funcional e por outro lado pela formação de tecido fibrótico não
funcional. Similarmente ao que ocorre nos países desenvolvidos, em Portugal
também as doenças cardiovasculares continuam a ser uma das maiores
causas de morbidade e mortalidade.
Devido à limitada capacidade regenerativa do coração e ao facto das terapias
existentes para tratar doenças cardiovasculares serem ineficientes ou
implicarem enormes riscos para o paciente, é urgente desenvolver novas
terapias mais eficazes. Nesse sentido, o uso de células multi e pluripotentes
tem contribuído na última década para um franco avanço nesta área. Muitos
ensaios clínicos têm sido feitos, ou decorrem ainda, onde se avalia a
capacidade regenerativa de células estaminais de diferentes origens na
reposição dos tecidos cardíacos danificados. Além disto pensa-se que certos
nichos de células progenitoras de cardiomiócitos residentes no coração adulto
possam representar um mecanismo endógeno de regeneração. De modo a
explorar este mecanismo tem-se recorrido a técnicas de isolamento destas
células para transplante em doentes cardíacos. No entanto, até agora as
melhorias evidenciadas por essas terapias celulares parecem estar associadas
a efeitos parácrinos que as células transplantadas exercem sobre os tecidos
envolventes, em detrimento da sua implantação no tecido danificado e
consequente diferenciação em novo tecido cardíaco. Em paralelo às terapias
celulares tem-se feito um esforço para desenvolver patches e scaffolds que
possam complementar estas terapias por facilitar o homing de células
transplantadas ao constituírem uma matriz onde estas células possam ser
envolvidas e desempenhar a sua função. Outra alternativa ao uso de células estaminais para uso em terapias de
regeneração cardíaca é o uso de células já diferenciadas com identidade
semelhante à do tecido a ser substituído. No caso do miocárdio, será
potencialmente interessante o uso de cardiomiócitos como fonte em
transplantes para a regeneração do tecido danificado. Tal abordagem é
especialmente interessante visto terem sido identificadas no coração
populações de novos cardiomiócitos derivados de cardiomiócitos já existentes,
que contribuem para o turnover normal do miocárdio. No entanto, para explorar
este mecanismo é necessário criar e otimizar protocolos eticamente aceitáveis
para experimentação humana de derivação em grande escala de
cardiomiócitos a partir de células pluripotentes. Tal objetivo pode ser alcançado
através do uso de fatores segregados que possam ser utilizados para estimular
o potencial cardiogénico das células pluripotentes.
A procura de genes envolvidos na cardiogénese têm-se tornado cada vez mais
importante com o objetivo de identificar potenciais fatores que possam modular
este processo biológico quer in vitro como in vivo. De facto, é possível modelar
in vitro com grande rigor os estadios iniciais da cardiogénese através da
diferenciação de células estaminais. Tal como ocorre in vivo, a especificação
das linhagens cardiovasculares in vitro implica uma transição para populações
de células progenitoras cardíacas com potencial de diferenciação cada vez
mais restrito e específico. Começando num estado de pluripotência, durante a
sua diferenciação estas especificam-se em mesoderme cardíaca e
posteriormente em células de todas as outras linhagens cardíacas. Para
monitorizar o seguimento deste processo biológico e para assegurar o correto
comprometimento nas várias linhagens cardíacas recorre-se à expressão
génica de marcadores genéticos específicos para cada linhagem esperada em
cada ponto específico de tempo. Através desta monitorização é possível
identificar células de mesoderme cardíaca pela expressão dos genes Mesp-1 e
Isl-1 a dia 4 de diferenciação das células estaminais, e também diferentes
populações de células progenitoras cardíacas pela expressão concomitante de
genes como Isl-1 e Nkx2.5 em dias posteriores. Assim é possível estabelecer
em laboratório um modelo fidedigno e manipulável para se estudar a
cardiogénese. Num rastreio génico efetuado pelo nosso laboratório em células progenitoras
cardíacas de galinha com expressão do marcador Nkx2.5, foram identificados
genes não caracterizados, mas com um potencial envolvimento na
cardiogénese. Um destes novos genes identificados foi o collagen and calcium
binding EGF domains 1 ou Ccbe1. Na literatura, é possível hoje ver que em
modelos animais knockout para este gene, um outro processo biológico é
afetado i.e. a linfangiogénese. Estes animais apresentam uma total ausência
de vasos linfáticos. Este fenótipo deve-se em parte ao papel já identificado que
o CCBE1 tem na maturação do fator pro-linfangiogénico VEGF-C. Em humanos
a síndrome de Hennekam (associado também a mutações em CCBE1), é
caracterizada pela existência de uma rede linfática disfuncional fazendo com
que estes apresentem um edema generalizado. Não obstante estes estudos,
recentemente verificou-se em ratinho e galinha a expressão deste gene nas
regiões embrionárias que dão origem ao coração, sugerindo assim também um
potencial papel neste processo. De facto, trabalho efectuado no nosso
laboratório veio a demonstrar que o silenciamento deste gene em galinha leva
ao desenvolvimento de defeitos cardíacos incompatíveis com a vida,
associados a uma redução da proliferação das células cardiacas. Também, em
ratinhos knockout para este gene é possível identificar um miocárdio
subdesenvolvido pelo estreitamento da camada compacta do miocárdio
também associado a problemas na proliferação. Assim, no presente trabalho
propusemo-nos a estudar mais detalhadamente o envolvimento deste gene nos
estadios iniciais da cardiogénese. Como este gene codifica para uma proteína
secretada, a verificar-se um importante papel na cardiogénese, a sua
manipulação como um fator de crescimento torna-se de grande interesse
visando a otimização de protocolos para derivação de cardiomiócitos.
Para estudar os estadios iniciais da cardiogénese recorremos ao uso de uma
linha de células estaminais duplamente transgénica que nos permite
acompanhar o processo de diferenciação para linhagens cardíacas pois
expressam a proteína fluorescente GFP sob o controlo do promotor de Nkx2.5
e a proteína fluorescente dsRed sob um promotor específico de cardiogénese
de Mef2c. Assim pode-se confirmar que é possível obter células progenitoras
cardíacas in vitro correspondentes aos estadios iniciais do desenvolvimento do
coração de ratinho. De seguida analisámos o padrão de expressão de Ccbe1 e verificou-se que coincide com o aparecimento da expressão dos marcadores
genéticos cardíacos, mostrando que in vitro a sua expressão ocorre aquando
da especificação das células para as linhagens cardíacas. Posteriormente
gerámos duas linhas estáveis de células estaminais com silenciamento de
Ccbe1 para avaliar o seu impacto na cardiogénese. Os resultados demonstram
que ao diferenciar estas células em agregados 3D conhecidos como corpos
embrióides (nome dado devido à sua semelhança física e funcional com um
embrião nos estadios iniciais do desenvolvimento), estas células são incapazes
de se especificar em mesoderme cardíaca pois apresentam a expressão de
Mesp-1 e Isl-1 reduzida. Em paralelo com estes resultados, foi possível verificar
que os corpos embrióides gerados a partir de células estaminais com
silenciamento de Ccbe1 apresentam um tamanho muito reduzido. Este defeito
é devido não a um aumento da morte celular mas sim a um défice na
proliferação das células estaminais silenciadas. Estes defeitos na proliferação
estão de acordo com outros estudos efetuados pela nossa equipa, em que
fibroblastos embrionários derivados de ratinhos knockout apresentam grandes
problemas na proliferação. Adicionalmente, em embriões de galinha foi
verificado necessidade de Ccbe1 para a correta proliferação de células
precursoras cardíacas para formar o tubo cardíaco. Em conjunto, estes
resultados demonstram que CCBE1 tem um papel importante em proliferação.
Tais resultados são corroborados por experiências onde foi feita a adição de
CCBE1 recombinante ao meio de cultura e se observou a recuperação parcial
dos corpos embrióides silenciados. Apesar das dificuldades em produzir
quantidades elevadas desta proteína recombinante, os resultados indicam que
CCBE1 foi capaz de aumentar a proliferação dos corpos embrióides
silenciados. No entanto, as células demonstram-se incapazes de se especificar
em mesoderme cardíaca, sugerindo que para além deste papel que Ccbe1 tem
em proliferação, o seu papel na cardiogénese é independente deste
mecanismo.
Conclui-se assim que Ccbe1 é indispensável para a especificação das células
em diferenciação em mesoderme cardíaca. Para vir a ser utilizado no futuro
como fator de crescimento em células estaminais em diferenciação, para
derivar grandes quantidades de células cardíacas, é necessário desenvolver ainda mais estudos que permitam ultrapassar as limitações associadas à sua
produção e à sua bioatividade.
Paralelamente a estes estudos, uma outra parte do meu trabalho incidiu numa
colaboração com uma equipa de bioinformática, na qual nos propusemos a
analisar o transcriptoma de diferentes tipos de células progenitoras cardíacas.
O objetivo desta análise seria primariamente identificar através de
sequenciação RNA novas isoformas de genes envolvidos na cardiogénese, e
adicionalmente identificar novos genes não caracterizados com potencial
impacto na cardiogénese. Para tal utilizámos a linha de células estaminais
duplamente transgénica já referida, da qual isolámos diferentes populações de
células progenitoras cardíacas em dias de diferenciação diferentes.
Conseguimos analisar o dataset resultante utilizando algumas ferramentas
bioinformáticas, que nos permitiu construir uma lista de genes potencialmente
envolvidos em cardiogénese ainda não caracterizados. Deste trabalho resultam
alguns genes que merecerão um estudo funcional mais detalhado visto
estarem claramente expressos nas regiões embrionárias cardiogénicas.
The identification and use of new growth factors to stimulate the cardiogenic potential of pluripotent cells is a safe and alternative approach to develop cell therapies to address the limited regenerative capacity of the heart. Collagen and calcium binding EGF domains 1 (Ccbe1) was firstly identified in our laboratory, which encodes for a secreted protein with potential involvement in cardiogenesis. Knockout animal models for this gene and humans with mutations in CCBE1, have lymphangiogenic defects, resulting in the absence of lymphatic vessels. This is in part due to the known described role that CCBE1 has in the processing of the pro lymphangiogenic factor VEGF-C. However, Ccbe1 is also expressed in the embryonic cardiogenic regions of both mouse and chick and in fact, silencing this gene in chick embryos leads to the development of heart defects incompatible with life. Noteworthy, knockout mice show an underdeveloped myocardium. The objective of the present work is to perform a detailed study of the involvement of this gene in the early stages of cardiogenesis. The results demonstrate that silencing the expression of Ccbe1 or blocking CCBE1 in differentiating stem cells, impairs their specification towards cardiac mesodermal lineages. Additionally, we found that differentiating Ccbe1 KD ESCs have a reduced proliferation rate that leads to smaller EBs. In agreement with this result, when supplementing the differentiating Ccbe1 KD ESCs lines with recombinant CCBE1, we were able to partially rescue the size of the EBs, but the expression of the cardiac mesoderm markers remained downregulated. These data suggest that those defects are independent from each other, but are intimately related to the disruption of Ccbe1, placing CCBE1 as a direct regulator of cell proliferation and cardiac mesoderm specification during ESC differentiation.
The identification and use of new growth factors to stimulate the cardiogenic potential of pluripotent cells is a safe and alternative approach to develop cell therapies to address the limited regenerative capacity of the heart. Collagen and calcium binding EGF domains 1 (Ccbe1) was firstly identified in our laboratory, which encodes for a secreted protein with potential involvement in cardiogenesis. Knockout animal models for this gene and humans with mutations in CCBE1, have lymphangiogenic defects, resulting in the absence of lymphatic vessels. This is in part due to the known described role that CCBE1 has in the processing of the pro lymphangiogenic factor VEGF-C. However, Ccbe1 is also expressed in the embryonic cardiogenic regions of both mouse and chick and in fact, silencing this gene in chick embryos leads to the development of heart defects incompatible with life. Noteworthy, knockout mice show an underdeveloped myocardium. The objective of the present work is to perform a detailed study of the involvement of this gene in the early stages of cardiogenesis. The results demonstrate that silencing the expression of Ccbe1 or blocking CCBE1 in differentiating stem cells, impairs their specification towards cardiac mesodermal lineages. Additionally, we found that differentiating Ccbe1 KD ESCs have a reduced proliferation rate that leads to smaller EBs. In agreement with this result, when supplementing the differentiating Ccbe1 KD ESCs lines with recombinant CCBE1, we were able to partially rescue the size of the EBs, but the expression of the cardiac mesoderm markers remained downregulated. These data suggest that those defects are independent from each other, but are intimately related to the disruption of Ccbe1, placing CCBE1 as a direct regulator of cell proliferation and cardiac mesoderm specification during ESC differentiation.
Description
Tese de Doutoramento, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2016
Keywords
Cardiogénese Cardiomiócitos Diferenciação de células estaminais Terapia regenerativa Doenças cardiovasculares Ccbe1 Sequenciação de RNA Cardiogenesis Cardiomyocytes ESCs diferentiation Cardiovascular disease RNA sequencing